本发明专利技术公开了一种能特异结合结核分枝杆菌抗原的核酸适配子及其用途。该适配子是针对结核分枝杆菌分泌抗原CFP10-ESAT6融合蛋白的小分子单链DNA（ssDNA），其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该小分子单链DNA具有与单克隆抗体类似功能，能直接并特异结合CFP10-ESAT6蛋白。采用适配子直接法或适配子和多克隆抗体的夹心法（或称酶联寡核苷酸夹心吸附法），能在2小时内快速有效地检测肺结核、肺外结核等病人血清（或血浆）中的CFP10和ESAT6抗原。本适配子建立的技术能灵敏检测结核病人血样或体液中的结核特异早期分泌性抗原CFP10-ESAT6蛋白或抗体，对血清中CFP10-ESAT6抗原检测的灵敏度可达到检测﹤0.01ng/ml。
Nucleic acid aptamer capable of specifically combining tuberculosis antigen and its application
The present invention discloses a nucleic acid aptamer capable of specifically binding to the antigen of Mycobacterium tuberculosis and its use. The aptamer is a small molecule single stranded DNA (ssDNA) secreted by the Mycobacterium tuberculosis secreted antigen CFP10-ESAT6 fusion protein, whose nucleotide sequence is shown in SEQIDNo.1. The small molecule single stranded DNA has the function similar to the monoclonal antibody and can directly and specifically bind CFP10-ESAT6 protein. Using sandwich aptamer direct method or aptamer and polyclonal antibody (or sandwich enzyme-linked oligonucleotide adsorption method), can quickly and effectively detect serum pulmonary tuberculosis, extra pulmonary tuberculosis patients in 2 hours (or plasma) in CFP10 and ESAT6 antigen. This technique can establish aptamer sensitive detection of tuberculosis patient's blood or body fluid in tuberculosis specific early secretory antigen CFP10-ESAT6 protein or antibody, the sensitivity of detection of CFP10-ESAT6 antigen in serum can be detected less than 0.01ng/ml.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子微生物学和感染免疫领域，涉及一种长约30nt的单链DNA(single strand DNA, ssDNA)适配子及其应用，该适配子能特异性、高亲和力地结合结核分枝杆菌特异性分泌蛋白CFP10、ESAT6，可用于血清学诊断结核病早期感染。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌(M. tuberculosis)感染机体所引起的疾病，涉及到全身多个脏器。目前，全球约1/3的人感染过结核分枝杆菌，每年约有200万人死于结核感染(Dye C SS,Dolin P PV, Raviglione MC. Consensus statement.Global burden of tuberculosis: estimated incidence,prevalence, and mortality by country. W. H. 0. Global Surveillance and Monitoring Project.J Am MedAssoc. 1999. 282:677-686.)，结核病正严重威胁人类的健康。目前我国结核感染的现状为每年新增结核病患达130万之多，每年因结核死亡的人数有15万，结核疫情呈现出患病率高、死亡率高、耐药率高、年递减率低的现状，疫情严重度仅次于印度(全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告.中华结核和呼吸杂志.2002. 25(1) :3-7.)。目前国际上针对结核分枝杆菌的检测技术分为三类细菌学检测、免疫学诊断、分子生物学诊断。细菌学检测是一种传统的检测手段，包括痰涂片抗酸染色以及痰培养，已经在临床上广泛应用多年，是公认的检测结核分枝杆菌的标准性诊断，痰涂片抗酸染色可能漏诊痰涂片阴性的患者，而痰培养又耗时长，需2-8周时间，因而其使用也受到极大的限制(Martinez A, Balandrano S, Parissi A, et al. Evaluation of newexternal quality assessment guidelines involvingrandom blinded rechecking ofacid-fast bacilli smears in a pilot project setting in Mexico. Int J Tuberc LungDis. 2005.9(3) :301-305.)。免疫学诊断结核分枝杆菌的方法有结核菌素试验以及特异性T淋巴细胞IFN-Y释放试验。这两者检测结核抗原特异性T细胞反应，结核菌素试验是利用纯蛋白衍化物(purified protein derivative, PPD)诱导的迟发型反应来对T细胞的功能进行检测，但PH)中大多数蛋白成分是各种分枝杆菌所共有成分，尤其是接种BCG后与感染结核分枝杆菌后，这两者很难区别，所以该方法存在特异性差的弊端。所以建立一种新型检测方法，实现对血清中结核分支杆菌感染的早期诊断，对于控制结核病疫情意义重大。分子生物学诊断主要包括DNA探针法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)以及定量PCR的方法。其中，PCR的方法主要针对结核分枝杆菌基因组中一段保守序列，通过PCR的方法能快速检测结核分枝杆菌，但是存在假阴性和假阳性，而且无法区分是活菌还是死菌，因此不能用于化疗后监测。CFP-IO和ESAT-6最早发现于结核分枝杆菌的早期培养滤液之中，是结核分枝杆菌早期、特异性地分泌的小分子量蛋白，不存在与卡介苗(BCG)中。编码这两种蛋白的基因分别为Rv3874和Rv3875，在结核分枝杆菌基因组中紧密相邻，受同一个启动子转录，所编码的两种蛋白质是以一种1:1的二聚体的形式分泌至细菌外，两者之间主要靠疏水性氨基酸以及范德华力紧密地相互作用(Renshaw PS, Panagiotidou P,Whelan A, et al.Conclusive evidence that the major T—cell antigens of theMycobacterium tuberculosis complex ESAT-6 andCFP-10 form a tight, I:lcomplexand characterization of the structural properties of ESAT-6, CFP—10, and theESAT-6-CFP-10complex. Implications for pathogenesis and virulence.J BiolChem. 2002, 277(24) :21598-21603.)。编码这两种蛋白的基因位于致病分枝杆菌基因组的RD-I区(region of difference-1), RD-I区只存在于致病结核分枝杆菌中，而在所有非致病的卡介苗-BCG菌株中均缺失，因而，检测CFP-IO和ESAT-6不仅能有效地辅助诊断结核分枝杆菌的感染，而且还能有效地区分是结核分枝杆菌感染还是BCG接种(Bardarov S, Bardarov JS Jr, Pavelka JMS Jr, et al. Specialized transduction:anefficient method for generating marked and unmarked targeted gene disruptionsin Mycobacterium tuberculosis, M. bovis BCG and M. smegmatis. Microbiology. 2002. 148 (PtlO):3007-17.)。适配子与抗体功能类似。适配子能特异性地识别靶分子，并能与靶分子高亲和力地结合。其与靶分子的结合的解离常数(Kd值)一般可达nmol/L，高者可达pmol/L。核酸 适配子与单克隆抗体相比具有如下优点1)单克隆抗体制备周期长，投入成本高。而适配子一般通过10-15轮筛选即可获得，制备周期较短，且投入成本低，大大节省资源；2)单克隆抗体属于蛋白质，对温度较敏感，长距离运输十分不易，而适配子却没有这方面的要求，用之前，只需先95°C变性，然后立即置于冰浴即可；3)不同批次制备的单克隆抗体效价差别比较大，而适配子可以通过化学合成、采用核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计精确定量；4)靶物质的免疫原性的好坏可能影响单克隆抗体的制备，但是对于制备其特异性的适配子却无影响；5)相比单克隆抗体而言，适配子分子量小，更容易进行化学标记，如荧光、生物素等标记。指数富集的配体系统进化(systematicevolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX),是一种结合体外筛选与PCR扩增的组合技术,从人工合成的随机寡核苷酸文库(RNA文库或者单链DNA文库)中筛选到能特异性地结合靶分子的寡核苷酸配体。该方法是基于小片段RNA和ssDNA分子能通过局部碱基配对形成特异的空间构象，并借助氢键、疏水键、范德华力等与靶分子高亲和力地结合(Tuerk C，Gold L. Systematicevolution of本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种能特异结合结核分枝杆菌分泌抗原CFPlO和ESAT6的核酸适配子,其核苷酸序列为 1)SEQ ID No. I所示的核苷酸序列； 2)SEQ ID No. I所示核苷酸序列经替换、缺失和/添加一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID No. I同等功能的序列；或， 3)含有SEQID No. I所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列，基于SEQ ID No. 2由I)所述序列向其3’和/或5...
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓联，唐晓磊，周亚雄，
申请(专利权)人：章晓联，
类型：发明
国别省市：
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