本发明专利技术的检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法以荧光素标记的含有蛋白结合位点的双链核酸为探针，该探针结合靶蛋白后形成的“核酸探针/脱氧核糖核酸结合蛋白”复合物为核酸探针提供了空间保护，可以使其不被核酸酶水解，从而可以与阳离子的水溶性共轭聚合物之间通过静电反应进行结合，使荧光素与聚合物之间有较近的距离可以发生高效的荧光共振能量转移。该方法基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶Ⅲ，包括以下步骤：a.制备可特异性结合蛋白质的双链脱氧核糖核酸荧光探针；b.将双链脱氧核糖核酸荧光探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合；c.用核酸外切酶Ⅲ对上述复合物进行酶切；d.在上述的反应体系中加入水溶性共轭聚合物进行荧光检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析及传感领域，特别涉及一种基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白的荧光检测方法。
技术介绍
脱氧核糖核酸结合蛋白是生物蛋白组中一类能够与序列特异性的脱氧核糖核酸发生结合并且产生重要功能的蛋白质，这类蛋白质在基因调控、基因重组、基因修复等细胞过程中发挥着重要作用，目前已成为功能基因组和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与细胞内脱氧核糖核酸结合蛋白的异常相关。脱氧核糖核酸结合蛋白的检测分析是研究其功能的主要手段。因此，有关检测分析脱氧核糖核酸结合蛋白的研究一直受到科学界的高度重视。目前用于研究脱氧核糖核酸与蛋白质相互作用的方法有很多，如凝胶迁移率分析法、印迹法等，虽然这些常规方法在脱氧核糖核酸结合蛋白的研究中发挥了重大的作用，但是这些技术工作量大、费时费力，并且操作过程中容易造成放射性物质污染。近年来，科学家们陆续报道了一些基于荧光染料的检测方法，如分子信标(Boon，Ε. Μ. ；Salas, J. Ε.； Barton, J. K. , Nat. Biotech. 2002, 20 (3) :282_286.)、荧光共振能量转移(Xu，X. ；Zhao, Ζ.； Qin, L. ；Wei, W. ；Levine, J. Ε. ；Mirkin C. Α.，Anal. Chem. 2008,80(14) :5616_5621·)等； 以及基于纳米金的比色检测(Ou，L. J. Jin, P. Y. ；Chu, X. Jiang, J. H. ；Yu, R. Q.，Anal. Chem. 2010，82，(14)，6015-24.)等，这些方法有效避免了放射性物质的污染，但是由于这些荧光探针需要双标记，给实验造成复杂化、分析效率低等缺陷。
技术实现思路
技术问题本专利技术要解决的技术问题是针对现有的脱氧核糖核酸结合蛋白检测方法存在的不足，提供一种核酸外切酶III辅助的，共轭聚合物荧光信号放大的脱氧核糖核酸结合蛋白检测方法，其具有较高的特异性和高灵敏度。有望在临床诊断和生物医学中针对脱氧核糖核酸结合蛋白的药物筛选提供一种新的技术。技术方案本专利技术为一种基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法，运用该技术可以实现对脱氧核糖核酸结合蛋白表达和活化水平的检测分析，该技术的核心是利用水溶性共轭聚合物与荧光素标记的单、双链核酸之间不同的荧光共振能量转移效率(Huang，Y. Q. ；Liu, X. F. ；Fan, Q. L. ；Wang，L. ；Song, S. ；Wang, L. H. ；Fan, C. ；Huang, W. , Biosensors and Bioelectronics 2009,24, (10), 2973-2978.)，以及脱氧核糖核酸结合蛋白在核酸特定位点处结合使其不被核酸外切酶III 降解的技术巧妙地结合在一起，从而达到对脱氧核糖核酸结合蛋白表达和活化水平的高效分析。本专利技术检测脱氧核糖核酸结合蛋白的荧光检测方法基于水溶性共轭聚合物和核酸3外切酶III，包括以下步骤a.制备可特异性结合蛋白质的双链脱氧核糖核酸荧光探针；b.将双链脱氧核糖核酸荧光探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合；c.用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切；d.在上述的反应体系中加入水溶性共轭聚合物进行荧光检测。步骤a制备的双链脱氧核糖核酸荧光探针为两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子。所述的核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子，含有脱氧核糖核酸结合蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列。所述的核酸分子A的3'端含有5个突出的核酸碱基，以便核酸外切酶III作用于双链脱氧核糖核酸探针时，能从B的3'端开始降解。所述的核酸分子B为5'端含有荧光素标记的核苷酸。所述的步骤b将标记的双链脱氧核糖核酸探针与脱氧核糖核酸结合蛋白进行结合，是脱氧核糖核酸结合蛋白与双链脱氧核糖核酸探针间发生序列特异性识别并结合的过程。所述的步骤c用核酸外切酶III对上述复合物进行酶切，是核酸外切酶III对核酸探针分子从双链脱氧核糖核酸的3'发生降解反应，逐个释放单核苷酸的过程。所述的步骤d中的水溶性共轭聚合物的发射光谱与荧光素的吸收光谱有较好的重叠，以便发生高效的荧光共振能量转移；荧光共振能量转移效率用529nm和450nm处的荧光发射强度的比值来表示，即I529nm/I 450nm°所述的荧光发射强度，用岛津RF-5301荧光分光光度计进行检测，激发波长为 404nm，发射波长扫描范围为410_650nm。技术效果本专利技术所述的荧光检测方法，无需大型仪器，经过简单的三个实验步骤即可完成对核因子NF-K B蛋白的分析检测，缩短了检测时间，并且该方法具有较高的选择性和灵敏度，能在比较复杂的混合蛋白体系中灵敏的检测出目标蛋白，具有较高的分析效率。附图说明图1是基于水溶性共轭聚合物和核酸外切酶III检测脱氧核糖核酸结合蛋白的原理示意图。图2为基于核酸外切酶III和水溶性共轭聚合物检测蛋白NF- κ B的荧光光谱图。 a为共轭聚合物的荧光光谱图；b为空白对照的荧光光谱图；(为含有靶蛋白的荧光光谱图。图3是基于核酸外切酶III和水溶性共轭聚合物的荧光检测方法对不同浓度的 NF-k B蛋白进行检测的荧光光谱图。NF-K B浓度范围为0 115nM。注解小图为不同浓度蛋白对应的荧光共振能量转移效率(I529mZI45tol)关系曲线图。具体实施例方式运用该技术检测脱氧核糖核酸结合蛋白时，首先要依据待检测的脱氧核糖核酸结合蛋白的脱氧核糖核酸结合位点的核苷酸序列，以及本技术运用的核酸外切酶III保护分析对核酸探针结构的要求，设计含有蛋白结合位点的标记核酸探针，对脱氧核糖核酸结合蛋白进行检测时。若溶液中存在脱氧核糖核酸结合蛋白，标记的核酸探针就会与相应的脱氧核糖核酸结合蛋白发生序列特异性的结合反应，形成的“核酸探针/脱氧核糖核酸结合蛋白”复合物为核酸探针提供了空间保护，在酸外切酶III酶切时，核酸酶由于空间阻碍而不能降解核酸探针，因此在加入水溶性共轭聚合物时，会由于较强的静电作用而与共轭聚合物结合，拉近荧光基团与共轭聚合物之间的距离，使其发生高效的荧光共振能量转移；当溶液中不存在脱氧核糖核酸结合蛋白时，裸露的核酸探针会被核酸外切酶III酶切，从而使荧光基团游离出来，无法与共轭聚合物发生结合，因此二者之间的距离较远，在荧光检测时，检测不到荧光共振能量转移。运用该技术包括如下四个步骤A.制备荧光标记的双链核酸探针；B.双链核酸探针与脱氧核糖核酸结合蛋白结合；C.核酸外切酶III酶切；D.对反应体系进行荧光检测；其中步骤A制备荧光标记的核酸探针是很重要的一步，为实现对脱氧核糖核酸结合蛋白的检测分析，核酸探针应具备下列结构a)核酸探针是由两条碱基序列反向互补的单链核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子；b)核酸分子A和B复性后形成的双链核酸分子，含有脱氧核糖核酸结合蛋白可识别并与之结合的核苷酸序列；c)核酸分子B为5'端标记有荧光素的核苷酸；核酸分子A为3'端比5'端突出 5个核酸粘性末端，核酸分子B为3'端与5'端平齐的平末端，核酸探针种类可以表现为多种形式，但是需要在核本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴奋，黄维，欧阳斓，黄艳琴，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：
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