一种水解酶活性的荧光检测方法技术

本发明专利技术公开了一种水解酶活性的荧光检测方法。所述方法通过将含有底物和Cu

Fluorescence detection method for hydrolytic enzyme activity

The present invention discloses a fluorescence detection method for hydrolase activity. The method comprises incorporating a substrate and a Cu

【技术实现步骤摘要】
一种水解酶活性的荧光检测方法
本专利技术属于生物分析
，涉及一种水解酶活性的荧光检测方法。
技术介绍
水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。简便、快速和灵敏地检测水解酶的活性，对于疾病的早期诊断、疗效观察和预后监测具有极其重要的意义。目前，对于水解酶的活性测定多采用荧光分析法和比色分析法。其中，荧光分析法是基于溶液中物质的荧光强度变化来对物质含量进行定量分析的方法，具有检测成本低、设备简单、操作简便、准确度高等优良特性。以碱性磷酸酶为例，目前可用于其活性测定的荧光分析方法有以下两类：(1)基于聚合诱导发光的原理，碱性磷酸酶将水溶性的磷酸-四苯乙烯水解生成不溶于水的四苯乙烯，四苯乙烯聚合后会产生荧光，从而实现对碱性磷酸酶的荧光分析，但是该方法存在选择性差，灵敏度低和抗干扰能力不足等缺陷(1.GuX,etal.(2013).Anewfluorometricturn-onassayforalkalinephosphataseandinhibitorscreeningbasedonaggregationanddeaggregationoftetraphenylethylenemolecules[J].Analyst,138(8):2427-2431；2.LiangJ,etal.(2013).Fluorescentlight-upprobewithaggregation-inducedemissioncharacteristicsforalkalinephosphatasesensingandactivitystudy[J].ACSAppliedMaterials&Interfaces,5(17):8784-8789.)；(2)以碳量子点作为荧光探针，碳量子点表面富集的羧基基团被引发聚集时可导致荧光的猝灭，从而实现对碱性磷酸酶的荧光分析，然而该方法存在检测成本高，抗干扰能力差和可能具有毒性等缺陷(1.QianZ,etal.(2015).Carbonquantumdots-basedrecyclablereal-timefluorescenceassayforalkalinephosphatasewithadenosinetriphosphateassubstrate[J].AnalyticalChemistry,87(5):2966-2973；2.QianZS,etal.(2015).Areal-timefluorescentassayforthedetectionofalkalinephosphataseactivitybasedoncarbonquantumdots[J].BiosensorsandBioelectronics,68:675-680.)。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种水解酶活性的荧光检测方法，该方法基于荧光分析测定水解酶活性，灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，可用于水解酶活性的临床检测。本专利技术的技术方案如下：一种水解酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：将含有底物和Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液与待测水解酶溶液孵育，生成Cu+-浴铜灵二磺酸络合物，测定反应液在402nm处的荧光发射强度，根据荧光发射强度与水解酶活性的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物为非还原性底物，与待测水解酶反应生成还原性产物。所述的Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针由Cu2+和浴铜灵二磺酸混合制备。所述的水解酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。所述的水解酶为α-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。所述的水解酶为β-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷。所述的水解酶为α-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。所述的水解酶为β-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。所述的水解酶为α-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷。所述的水解酶为β-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷。所述的水解酶为碱性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。所述的水解酶为中性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。所述的水解酶为酸性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。本专利技术的水解酶活性的荧光检测方法，底物不具有还原性，不能还原Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针，底物在水解酶的作用下能够生成还原性产物，产生的还原性产物能将Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针还原成Cu+-浴铜灵二磺酸络合物。在含有底物和Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液与待测水解酶溶液孵育过程中，底物与水解酶反应生成还原性产物，还原性产物将Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针还原成Cu+-浴铜灵二磺酸络合物，导致检测液在402nm处的荧光发射信号下降。本专利技术通过测定反应液在402nm的荧光强度，最终根据荧光强度与水解酶活性的标准曲线关系，得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。本专利技术只需一步操作即可实现对水解酶活性的测定，荧光探针制备过程极其简单，具有化学性质稳定、水溶性好和生物相容性好等优良特性。本专利技术的荧光检测方法具有灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短和成本低廉等优点，可用于临床样品中水解酶活性的快速、高灵敏检测，极大地降低了检测成本。附图说明图1是实施例1中含有不同组分的检测液的荧光发射光谱图，其中，a为不加碱性磷酸酶，b为不加抗坏血酸-2-磷酸，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。图2是实施例2中荧光发射强度与碱性磷酸酶活性之间的关系曲线图。图3是实施例3中含有不同蛋白质样品的检测液在402nm处荧光发射强度的比较图，其中，a为碱性磷酸酶，b为酸性磷酸酶，c为人血清蛋白酶，d为胰蛋白酶，e为凝血酶，f为血红蛋白，g为空白对照。图4是实施例4中荧光发射强度与血清样品体积之间的关系曲线图。图5是实施例5中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加α-半乳糖苷酶，b为不加对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。图6是实施例6中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加β-半乳糖苷酶，b为不加对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。图7是实施例7中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加α-葡萄糖苷酶，b为不加对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。图8是实施例8中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加β-葡萄糖苷酶，b为不加对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。图9是实施例9中含有不同组分的检测液的荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有底物和Cu

【技术特征摘要】
1.一种水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有底物和Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液与待测水解酶溶液孵育，生成Cu+-浴铜灵二磺酸络合物，测定反应液在402nm处的荧光发射强度，根据荧光发射强度与水解酶活性的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物为非还原性底物，与待测水解酶反应生成还原性产物。2.根据权利要求1所述的水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于，所述的Cu2+-浴铜灵二磺酸荧光探针由Cu2+和浴铜灵二磺酸混合制备。3.根据权利要求1所述的水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于，所述的水解酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。4.根据权利要求1所述的水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于，所述的水解酶为α-半乳糖苷酶，底物为对氨基苯基-α-D-吡喃...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔金明，胡琼，梅亚琦，何玟辉，张学记，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32