鳖亚科生物成分特异性实时荧光检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及鳖亚科生物成分特异性实时荧光检测方法及其试剂盒。本发明专利技术揭示了一种可特异性鉴定鳖亚科生物成分的引物，所述引物针对含有鳖亚科生物成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有鳖亚科生物成分的DNA不发生特异性扩增。本发明专利技术还提供了一种简化的PCR检测方法，所述的方法可良好地应用于鉴定鳖亚科生物成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
鳖亚科生物成分特异性实时荧光检测方法及其试剂盒
本专利技术属于PCR检测领域，更具体地，本专利技术涉及鳖亚科生物成分特异性实时荧光检测方法及其试剂盒。
技术介绍
鳖亚科生物俗称甲鱼，隶属爬虫纲Reptilia龟鳖目(Testudines)、鳖科(Trionychidae)，为软壳水生龟的统称，中国现存最主要的有中华鳖(Pelodiscussinensis)、鼋(Pelochelyscantorii)、山瑞鳖(Paleasteindachneri)等，其中最为常见的为中华鳖，最受人们欢迎，其需求量也最大，经济价值也最高。鳖亚科生物不但味道鲜美、高蛋白、低脂肪，而且是含有多种维生素和微量元素的滋补珍品，能够增强身体的抗病能力及调节人体的内分泌功能，也是提高母乳质量、增强婴儿的免疫力及智力的滋补佳品(国家药典委员会，中华人民共和国药典，iv部[Z]，北京：北京化学工业出版社，2000:1-317)。它不仅是餐桌上的美味佳肴，而且是一种用途很广的滋补药品和中药材料，自古以来就被人们视为滋补的营养保健品。由于鳖亚科生物具有较高的营养价值以及药用价值，近些年需求量逐年增加。2013年我国鳖亚科生物总产量达30万吨。大多数鳖亚科生物(如中华鳖)，自然外塘养殖需要3年以上的时间才能作为商品上市。由于其生长周期慢，对于一些加工品鳖亚科生物商品，一些不法商家，受利益驱使，用一些非鳖亚科生物材料来假冒替换鳖亚科生物的现象时有发生。目前，中国的鳖亚科生物制品主要有粉、液、酒、胶囊等，这些深加工产品由于缺乏完整的形态学特征，故很难从形态学上鉴定。某些不法商贩为利益最大化，常用非鳖亚科生物成分充当鳖亚科生物，这不仅影响鳖亚科生物贸易市场的公正性，而且还侵害了消费者的合法权益。为了维护消费者权益，规范交易市场，因此建立鳖亚科生物成分的分子检测方法尤为重要。加工品鳖亚科生物，由于缺乏外观特征，其真伪很难辨别。而目前，还未见国内外有公开报道针对鳖亚科生物成分鉴定方法。因此，本领域需要建立快速、准确、易推广的鳖亚科生物成分的鉴定方法，用于对鳖亚科生物进行明确的区分。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供鳖亚科生物成分特异性实时荧光检测方法及其试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种鉴定鳖亚科生物成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鳖亚科生物成分。在一个优选例中，所述的方法中，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物以及SEQIDNO:3所示的Taqman探针进行实时荧光PCR检测。在另一优选例中，所述的方法中，以真核生物18SrRNA作为检测内参，检测真核生物18SrRNA的引物如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。在另一优选例中，所述的方法中，以SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的引物以及SEQIDNO:6所述的Taqman探针进行真核生物18SrRNA的实时荧光PCR检测。在另一优选例中，所述的方法中，所述的待测样品是食品、饮料、保健品。在本专利技术的另一方面，提供一种用于鉴定鳖亚科生物成分的引物，所述引物是引物对，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。在本专利技术的另一方面，提供一种用于鉴定鳖亚科生物成分的Taqman探针，所述的探针序列如SEQIDNO:3所示。在本专利技术的另一方面，提供所述的引物和所述的Taqman探针的用途，用于从待测样品中鉴定鳖亚科生物成分。在本专利技术的另一方面，提供一种鉴定鳖亚科生物成分的试剂盒，其中包括前面所述的引物和Taqman探针。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：检测真核生物18SrRNA的引物，其序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；较佳地，还包括SEQIDNO:6所述的Taqman探针。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鳖亚科生物成分的方法的使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、特异性试验结果。图2、鳖亚科生物特异性序列标准曲线及曲线方程。图3、实际样品PCR扩增结果。其中，A、B为2种鳖亚科生物罐头；C、D、E为三种鳖亚科生物干粉。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种可特异性鉴定鳖亚科生物成分的引物，所述引物针对含有鳖亚科生物成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有鳖亚科生物成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本专利技术人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定鳖亚科生物成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。引物和探针本专利技术人通过鳖亚科生物及其它物种在基因层面的比较和筛选，确定将线粒体细胞色素b基因作为检测的靶基因，经比对分析和反复试验，获得了特异性地扩增鳖亚科生物的引物、探针，从而建立了用于检测鳖亚科生物成分的实时荧光PCR方法，达到鉴定鳖亚科生物成分的目的，确保食品质量安全。因此，本专利技术提供一种引物，所述的引物具SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本专利技术的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。本专利技术还提供一种探针，所述的探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是Taqman探针，从而便于实时荧光检测。本专利技术还提供了一组适用于检测内参的引物探针，其以真核生物18SrRNA作为检测靶标。作为本专利技术的优选方式，提供了以真核生物18SrRNA作为检测内参，检测真核生物18SrRNA的引物，其序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。更优选地，还提供了特异性鉴定所述引物的扩增产物的Taqman探针，其序列如SEQIDNO:6所示。PCR方法基于本专利技术所提供的适用于鉴定鳖亚科生物成分的特异性引物及探针，本专利技术还提供了一种鉴定鳖亚科生物成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鳖亚科生物成分。获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本专利技术的方法可采用常规的PCR技术进行。在本专利技术的优选实施方式中，采用Taqman实时荧光PCR检测技术：在PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的标记有荧光素的Taqman探针，该探针为一寡核苷酸，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定鳖亚科生物成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鳖亚科生物成分。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定鳖亚科生物成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鳖亚科生物成分。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物以及SEQIDNO:3所示的Taqman探针进行实时荧光PCR检测。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以真核生物18SrRNA作为检测内参，检测真核生物18SrRNA的引物如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的引物以及SEQIDNO:6所述的Taqman探针进行真核生物18SrRNA的实时荧光PCR检测。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李想，苗丽，王梦怡，高琴，
申请(专利权)人：中华人民共和国上海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：上海,31