一种检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂，由裂解液、检测缓冲溶液、检测底物溶液和sEH抑制剂溶液组成。本发明专利技术还提供了制备上述试剂的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂，具体地涉及一种用于检测可溶性表氧化物水解酶活性的试剂，该试剂通过荧光检测可以测定细胞或组织中可溶性表氧化物水解酶活性。
技术介绍
可溶性表氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase, sEH,又称EPXH2)广泛存在于哺乳动物中，在肝脏、肾脏、肺、心脏、脑、脾脏、血管内皮和平滑肌等多个组织器官中都有分布；sHl蛋白是由两个大小为62kD的单体组成的同源二聚体，每个单体的N端和C端具有不同的酶活性，N端具有磷酸酶活性，C端具有表氧化物水解酶的活性，可以水解表氧化脂肪酸或其它表氧化物，将其转化为相应二醇，从而降低表氧化物的化学反应性，增加其水溶性，改变它们的生物活性(Newman Jff7Prog Lipid Res，2005 ;44 :1-5)。sHl的C端活性在多种疾病过程中发挥着关键的调节作用，抑制其活性可以降低血管紧张素2所导致的高血压(Imig JD, Hypertension, 2002 ;39 :690-94)、心肌肥大(Ai D, Proc Natl Acad Sci USA, 2009 ;106 :564-69)、动脉粥样硬化(Ulu A, J Cardiovasc Pharmacol, 2008 ；52 :314-23) 等，因而测定细胞及组织中的sHl活性对于相关疾病的研究及药物的开发具有至关重要的作用。目前测定sEHC端活性的方法主要有以下几种通过LC/MS/MS或ELISA的方法检测体液、尿液、血液、细胞裂解液或上清及组织匀浆中的sEH内源性底物EETs与产物 DHETs 的比例来反映 sEH 的活性(Nithipatikom K, Analytical Biochemistry, 2001 ;298， 327-336, Newman Jff, Prog Lipid Res，2002 ;43，1563-78);或将细胞裂解液与 EETs 或放射性标记的sHl底物孵育，检测产物生成量从而测定sHl的活性(Liu Y,Proc Natl Acad Sci USA，2005 ; 102，16747-52，Ai D, Proc Natl Acad Sci USA，2009 ; 106 :564-69)。这些方法中EETs及DHETs不稳定，极易氧化和降解且含量较低，对于实验条件和仪器设备要求高，而使用放射性物质，易造成污染或对人体伤害，因而限制了其应用。Nicola M. Wolf等人报道可以使用PHOME等化合物作为sHl的底物，高通量地评估 sEH 抑制剂的效果(WolfNM, Analytical Biochemistry, 2006 ；355 :71-80) 这类化合物被 sEH作用后的产物可以被激发出荧光，而化合物本身并不能被激发荧光，但此方法只被用于体外检测重组纯化sEH的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂。本专利技术的又一目的在于提供一种制备上述试剂的方法。为实现上述目的，本专利技术提供的检测组织或细胞中可溶性表氧化物水解酶活性的试剂，由裂解液、检测缓冲溶液、检测底物溶液和Sffi抑制剂溶液组成；通过下述方法制备得到裂解液包括低渗溶液和苯甲基磺酰氟溶液，其中低渗溶液可以采用去离子水，也可以是如下配制的低渗溶液将三羟甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化镁15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至IOOml ；本专利技术优选的低渗溶液是去离子水。苯甲基磺酰氟溶液将苯甲基磺酰氟溶于异丙醇中，浓度为IOOmM ；苯甲基磺酰氟溶液与低渗溶液的体积比为1/1000 1/100 ；检测缓冲溶液将三羟甲基氨基甲烷溶解至水中，浓度为50禮，调节pH至6.8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量为O. 1-0. 3mg/ml ；检测底物溶液将Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亚砜中配成5mM的溶液；sHl抑制剂溶液将sHl抑制剂溶解至二甲基亚砜中，配成IOmM的溶液。本专利技术提供的制备上述试剂的方法，其主要包括I)制备裂解液，所述裂解液包括低渗溶液和苯甲基磺酰氟溶液低渗溶液可以采用去离子水，也可以是如下配制的低渗溶液将三羟甲基氨基甲烷55-65毫克、氯化镁15-25毫克、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 35-40毫克、乙二胺四乙酸3-5毫克溶解于水中，调节pH至7. 0-7. 5，水定容至100ml，存放于 4。。；本专利技术优选的低渗溶液是去离子水；2)苯甲基磺酰氟溶液将苯甲基磺酰氟溶于异丙醇中，浓度为lOOmM，存放于-20°C至 4°C ；苯甲基磺酰氟溶液与低渗溶液的体积比为1/1000 1/100 ；3)检测缓冲溶液将三羟甲基氨基甲烷溶解至水中，浓度为50mM，调节pH至6.8-7. 3，加入牛血清白蛋白溶解，牛血清白蛋白的加入量为O. 1-0. 3mg/ml，存放于4°C ；4)检测底物溶液将Epoxy Fluor 7溶解至二甲基亚砜中配成5mM的溶液，存放于-20。。；5) sHl抑制剂溶液将sHl抑制剂溶解至二甲基亚砜中，配成IOmM的溶液，存放于-20 0C ο所述的sE；H抑制剂为12-(3-金刚烧-I-基-服基)_正十二烧酸、反式 _4--苯甲酸{trans-4- -benzoic acid、t-AUCB}或1-(1-甲磺酰哌唳_4_基)-3-(4-三氟甲氧基苯基)-尿素。本专利技术的优点是I)利用该试剂的检测方法快速，简便易行，可以进行高通量检测。样本处理方法简单，除裂解液不同外，其它与普通蛋白提取方法无异，反应过程为酶促反应，无高难度技术， 可操作性强；操作中所使用试剂为无毒或低毒物品，不存在放射性，不会造成污染及对操作者的伤害；样本处理之后整个反应过程用时不超过I小时，检测快捷；使用96孔板，一次可检测40多个样本，方便大样本检测，且样品用量少。2)实现了组织特异的sEH活性检测。以往的检测方法多是检测纯品sEH活性，或通过检测EETs与DHETs的比值，间接反映sHl的活性，但EETs或DHETs都不稳定，在样本保存和提取过程中，容易被氧化降解，使方法准确性降低。而本方法则可直接检测组织中sEH 的活性，对于药物的研发和sEH在不同疾病模型中的作用评估提供了更为便捷的条件。附图说明图I是小鼠肝脏和肾脏sEH活性测定加样示意图；图中的标记说明如下 空白对照； 肝脏裂解上清；·肝脏裂解上清+sEH抑制剂；@肾脏裂解上清； 肾脏裂解上清+sEH抑制剂。图2是小鼠肝脏sEH活性-反应时间曲线；图3是小鼠肾脏sEH活性-反应时间曲线；图4是sEH抑制剂tAUCB饮水给药对小鼠肝脏sEH活性的抑制效果；图5是sHl抑制剂tAUCB饮水给药对小鼠肾脏sEH活性的抑制效果；图6是HEK293细胞sHl活性测定加样示意图；图中的标记说明如下 空白对照；_细胞裂解上清；·细胞裂解上清+sEH抑制剂；图7是HEK293细胞sHl活性-反应时间曲线； 图8是sHl抑制剂tAUCB对HEK293细胞中sHl活性的抑制效果；图9是HEK293细胞过表达sHl后活性测定结果。具体实施例方式本专利技术通过检测组织本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱毅，刘燕，何金龙，李楠，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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