本发明专利技术公开了实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法，是通过对荧光蛋白结构的改造，插入蛋白水解酶的作用位点，观察荧光蛋白荧光的有无及强弱的变化，来实现蛋白水解酶活性的监测；具体如下：对荧光蛋白进行循环置换，用蛋白水解酶识别序列将N端和C端连接改变它们的空间结构，同时产生新的N端和C端，经循环置换后的荧光蛋白即为蛋白水解酶活性指示剂（PAI），在经相应的蛋白水解酶作用后，PAI变成由荧光蛋白的N端和C端两部分肽段组成，这两部分经荧光互补产生荧光。本发明专利技术以指示剂为工具在体内实时监测蛋白水解酶在生理及病理过程中的变化，在体外监测样品中蛋白水解酶的活性，灵敏、直观、便捷、省时。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及监测指示剂的制备方法及应用方法，具体涉及。
技术介绍
随着科技水平的不断进步，生物化学逐渐成为探索活体细胞合成代谢、分解代谢基本原理的主要手段，使人们能够了解各种酶的功能，并通过晶体学从原子层面揭示蛋白质的结构，为深入研究及有效利用打下基础。然而，生物化学中并未能提供一种实验工具，用以定量并在实验中从时间、空间上精确地监控分子水平的细胞内或细胞外生理病理变化，从而确定活体系统的动态行为。为获得这些认识，实验方面及概念上的新工具必不可少。如今，在20世纪60年代分离自维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP )以及经改造获得的突变体构成的“GFP家族”蛋白，使这样一种工具成为现实并得到飞速发展(Shimomura 0，Johnson FH, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol, 1962 (59) :223_239)。荧光蛋白常用于基因转录或作为一种与目的基因结合的报告基因。荧光蛋白基因在N端或C端与异源基因接合够成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然荧光蛋白相似的荧光特性(Jones JJ, Bridges AM, Fosberry AP, et al. Potential of real-time measurement of GFP-fusion proteins. J Biotechnol, 2004 (109) : 201 - 211 )。荧光蛋白的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以用来在活体内追踪某一特定蛋白的合成、运输和定位，还用于细胞器的动态观察、有丝分裂的研究、细胞骨架的成分分析和细胞分泌过程观察等，甚至也可以对某些DNA序列在活细胞的动态变化进行分析研究(Chalfie M，Tu Y, Euskirchen G, et al。Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994 (263) :802-805.)。与传统抗体标记技术相比具有更高的灵敏度、简化细胞固定、渗透压调整、抗体培养等操作步骤，可用荧光显微镜直接进行观察，而且荧光蛋白没有毒性，在不同的生物中都能高水平表达且不影响其生理机能。双分子焚光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)是由荧光蛋白研究发展而来的一项新技术。将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N端与C端2个多肽，称为N片段和C片段。这两个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发的组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但当这两个荧光蛋白的片段分别连接到一组相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上相互靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，散发焚光(Kerppola T K. Visualization of molecular interactions using bimolecular fluorescence complementation analysis: characteristics ofprotein fragment complementation. Chem Soc Rev,2009( 10) : 2876- 2886.)。 BiFC技术一经出现迅速得到广泛应用，已经成功用于多种蛋白质的相互作用，如大肠杆菌 (Morell Mj Espargaro A, Aviles FX，et al. Detection of transient protein-protein interactions by bimoIecuIar fluorescence complementation: the Abl_SH3 case. Proteomics. 2007 (7) : 1023-1036)、酵母细胞(Sung MKj Huh WK. Bimolecular fluorescence complementation analysis system for in vivo detection of protein-protein interaction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2007(9):767-775)、丝状真菌(Hoff B，Kiick U. Use of bimolecular fluorescence complementation to demonstrate transcription factor interaction in nuclei of living cells from the filamentous fungus Acremonium chrysogenum. Curr Genet，2005 (2) : 132-138)、哺乳动物细胞(Kerppola TK . Bimolecular fluorescence complementation: visualization of molecular interactions in living cells. Methods Cell Biol，2008 (85):431-470) 等。此技术的优点在于适用范围广泛，所研究的蛋白处于其天然的环境之中，能够直观的观察蛋白质的相互作用，并且与应用广泛研究体内蛋白质相互作用的酵母双杂交技术相比耗时比较短。焚光共振能量转换技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是荧光蛋白研究过程中发展的另一项研究蛋白质相互作用的技术。当一个荧光分子(如荧光蛋白，作为供体)的发射谱与另一个荧光分子(作为受体)的吸收谱有重叠时，若这两个荧光分子距离靠近，则会通过供体和受体之间电磁偶极相互作用发生非辐射的能量转移。由于要发生能量转移要求供体和受体之间的距离小于10纳米(Day R N, Davidson M W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev, 2009( 10 )J887-2921.)，因此可用于研究分子的空间关系及相互作用。现已经发展了数十种不同吸收发射谱的荧光蛋白，已有许多实用的荧光蛋白组合(Shcherbo D，Souslova E A, Goedhart J, et al. Practical and reliable FRET /FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol，2009 (9) 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李兵辉，张矫，
申请(专利权)人：李兵辉，
类型：发明
国别省市：
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