一种高蛋白含量脑蛋白水解物的制备方法技术

本发明专利技术公开一种高蛋白含量脑蛋白水解物的制备方法，包括(1)组织匀浆；(2)液化；(3)蛋白浓缩；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤。所述的步骤(3)使用N-取代聚丙烯酰胺或N-取代聚丙烯酰胺共聚物凝胶在5-25℃浓缩蛋白，LCST以上温度回收凝胶，反复利用。本发明专利技术解决了现有方法脑蛋白水解物蛋白含量低的问题，同时意外解决了有机溶剂脱脂，造成溶剂残留和环境危害的问题。本方法所得水解液多肽含量达88％以上，符合国家标准。

【技术实现步骤摘要】
一种高蛋白含量脑蛋白水解物的制备方法
本专利技术涉及药品和保健食品领域，特别涉及一种脑蛋白水解物的制备方法。
技术介绍
脑蛋白水解物是将动物脑组织经酶水解后获得的一种活性多肽，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。脑蛋白水解物的基本生产工艺如下：动物脑组织去除表面的粘膜及血渍后，加水匀浆，脱脂，胃蛋白酶酶解，胰蛋白酶酶解，超滤。采用现有技术生产工艺所制备脑蛋白水解液含氮量低，国家药品标准WS1-XG-025-2000规定，干燥后物质含氮量为8％-10％，换算成氨基酸和多肽含量在60％左右，40％的未知物质造成的潜在临床风险可想而知，因此国家食品药品监督管理局对此类产品的标准在不断提高，逐步淘汰落后产品。此外，现有工艺中脱脂的目的为蛋白酶解更彻底，过滤通畅，方法一般采用丙酮或丙酮复合溶剂脱脂，例如中国专利200410043939.2，94104516.1，但因大量使用有机溶剂，可造成环境危害和溶剂残留。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脑蛋白水解物的制备方法。其包括(1)组织匀浆；(2)液化；(3)蛋白浓缩；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤。(1)组织匀浆：冷冻或新鲜哺乳动物脑，清洗，加水匀浆；(2)液化：上述匀浆液中加入3-5倍量注射用水，0.1MNaOH调节pH值至7.5-8.5，搅拌10min-20min，温度5℃-20℃。(3)蛋白浓缩：将步骤(2)所得碱化液过滤，使用温敏凝胶浓缩回收其中的水溶性蛋白，温敏凝胶系聚N-取代丙烯酰胺或聚N-取代丙烯酰胺共聚物，其基本结构为[-CH2-CHRCONR‘R”-]m[-A-]n[-B-]x，其中R为H或1-5个碳原子的烷基；R’为H或2-5个碳原子的烷基；R”为2-5个碳原子的烷基；优选R为H或甲基，R’和R’‘为2-4个碳的烷基；-A-为可选基团，来源于亲水性单体，优选的，-A-摩尔占比1％-5％；-B-基团来源于单体双功能交联剂，摩尔占比0.5％-10％。n可以为0，m和x的变动范围比较宽，根据单体和交联剂摩尔比确定。优选凝胶为聚N-异丙基丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-甲基丙烯酸)钠盐，以N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)为交联剂。本步所用凝胶为颗粒状，其膨胀和收缩温度应在5℃范围内，最小可膨胀为其原始体积的5倍。步骤(3)浓缩时温度应低于所用温敏凝胶的最低临界相变温度(LCST)，优选5℃-25℃。本步所用温敏凝胶膨胀后可升温收缩，回收利用，收缩温度高于最低临界相变温度(LCST)。其收缩后体积为膨胀体积的5％-20％。可使用温敏凝胶反复浓缩，直至蛋白浓度达15％-25％。本步浓缩使用的设备为双层圆柱状大桶，内层大桶盛装温敏凝胶，侧壁开40目筛孔，并可自由从外层桶中取出，搅拌桨深入内层桶以便搅动温敏凝胶。(4)胃蛋白酶酶解：将步骤(3)所得滤渣加水匀浆，盐酸调整pH＝1-3，升温至35℃-45℃，加入脑重量1％～3％的胃蛋白酶，搅拌，水解10-20小时，冷却，过滤，得胃酶水解液；优选的，调节pH＝2，温度40℃，加入脑重量1.5％的胃蛋白酶，水解15小时。(5)胰蛋白酶酶解：将步骤(4)胃酶水解液用NaOH调整pH＝7-9，升温至40℃-60℃，加入脑重量1％-3％的胰蛋白酶酶解，搅拌，水解2-10小时，完毕加热微沸10min灭活，冷却，过滤，得胰蛋白酶水解液；优选的，调节pH＝7.6-8.0，温度45℃，加入2％脑重量的胰蛋白酶，水解5小时。(6)超滤：将步骤(5)所得酶解液，调节pH值至中性(6.5-7.5)，用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行超滤，收集分子量小于10000道尔顿的液体，所得超滤液即脑蛋白水解物。本专利技术所述的哺乳动物系指人除外的其他哺乳动物，包括猪、牛、马、羊、兔、狗等，优选猪、牛、羊。本专利技术进一步要求保护本专利技术的脑蛋白水解物与一种或多种载体和/或稀释剂制的药物及保健品组合物，可以制成市场上可接受的任一剂型。用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等：也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。本专利技术进一步要求保护本专利技术的脑蛋白水解物在制备治疗和/或预防脑功能障碍的药物和/或保健品中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：(1)本专利技术选用N-取代聚丙烯酰胺或N-取代聚丙烯酰胺共聚物温敏凝胶浓缩蛋白，有效去除小分子杂质，降低产品临床或日常使用的风险。。(2)本专利技术解决脑蛋白水解物蛋白含量问题的同时，意外的发现，不使用溶剂脱脂，本专利技术同样解决了蛋白酶解彻底性问题，且后续工艺过滤顺畅，最终产品脂肪含量低。具体实施方式下面详细叙述本专利技术的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。比较实施例1分别采用不同工艺进行实验，比较最终产品收率、活性多肽含量、过滤难易、溶剂残留、脂肪含量。现有工艺步骤如下：(1)猪脑匀浆；(2)脱脂；(3)胃蛋白酶酶解；(4)胰蛋白酶酶解；(5)超滤，即得。本专利技术工艺步骤如下：(1)猪脑匀浆；(2)液化；(3)凝胶浓缩蛋白；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤，即得。不同工艺对应获得的产品如表中所示：1以干物质计。2实际为多肽和游离氨基酸含量，以凯氏定氮法测定氮含量乘以6.25计算。3凝胶1为聚N-异丙基丙烯酰胺，凝胶2为聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-甲基丙烯酸)钠盐，交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)。结果表明，采用聚N-异丙基丙烯酰胺和聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-甲基丙烯酸)钠盐浓缩蛋白产品多肽含量最高，收率好，过滤简单，丙酮脱脂工艺产品脂肪含量低，但有效物质含量低，残留有毒有害物质。实施例1将新鲜猪脑去除脑膜和血管，用水洗净，沥干，胶体磨磨细，收集匀浆液，加入猪脑3倍重量的注射用水，0.1MNaOH调节pH值至8.0，搅拌15min，过滤，滤液备用。在浓缩设备内层桶中加入脑重量0.1倍量聚N-异丙基丙烯酰胺温敏凝胶(北京中融阳光投资管理有限公司研究所提供)和少量聚二甲基硅氧烷(消泡剂)，将上步备用滤液加入浓缩设备中，保持滤液温度在15℃-20℃间，搅拌40min，提出膨胀的凝胶，用少量注射用水仔细清洗，水洗液合并入浓缩液。将膨胀的凝胶置入40℃废液罐中，相变收缩后的凝胶可再次重复上述操作，直至浓缩液中蛋白含量达到20％。将浓缩液倒入酶解罐，加1.5倍脑重量注射用水，升温至42℃，用4.5％盐酸调pH＝1.5，加入脑重量1.5％的胃蛋白酶，维持pH＝1.5-1.7，水解8小时，用5MNaOH将胃蛋白酶水解浆液调pH至7.8，加入脑重量1.5％的胰蛋白酶，搅匀后，pH值维持在7.5-8.0，42℃水解4小时，酶解结束后加热升温至微沸，保持10min，冷却降温，离心机离心，将离心后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：(1)组织匀浆；(2)液化；(3)蛋白浓缩；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤。其特征在于，步骤(3)所述的蛋白浓缩采用聚丙烯酰胺温敏凝胶进行浓缩。

【技术特征摘要】
1.一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：(1)组织匀浆；(2)液化；(3)蛋白浓缩；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤；其特征在于，所述步骤(2)条件为：NaOH调pH值7.5-8.5，搅拌10-20min；所述步骤(4)条件为：胃蛋白酶用量1％～3％，pH值为1-3，酶解温度为35℃-45℃，酶解时间10-20h；所述步骤(5)条件为：胰蛋白酶用量1％～3％，pH值为7.8，酶解温度为40℃-60℃，酶解时间2-10h；所述的步骤(6)过程中，用相对截留分子量为10000道尔顿的膜超滤；步骤(3)所述的蛋白浓缩采用聚丙烯酰胺温敏凝胶进行浓缩，浓缩温度为5℃～25℃，反复浓缩，直至蛋白浓度达15％～25％。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：林波，吴佳鑫，于秀玲，刘爽，韩风雨，孔新颖，李洪泽，
申请(专利权)人：内蒙古天奇生物科技有限公司，内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，赤峰陆尔草中蒙药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15