一种土壤羟胺还原酶活性检测时的显色方法技术

本发明专利技术涉及一种土壤羟胺还原酶活性检测时的显色方法，具体地说是在土壤培养后的提取液中加入三价铁盐溶液和α－α’联吡啶溶液并在微酸性环境下显色，然后应用分光光度法比色测定提取液中的羟胺浓度。将其吸光值同标准曲线进行对比得到培养液中的羟胺浓度，从而计算得到土壤中羟胺还原酶的活性。显色反应在常温下进行，所得溶液显橙色，比色波长为５２０ｎｍ。如果在４０ｍｉｎ内不能完成比色，应加入掩蔽剂阻止副反应发生。改进后的显色方法同传统的显色方法比较，具有灵敏度高、系统误差较小、准确度和精密度高、显色剂用量较少等优点，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及应用分光光度法检测土壤中羟胺还原酶活性过程中的显色 方法，具体地说是一种应用配合物显色方法间接测定土壤培养液中羟胺浓 度的显色方法。
技术介绍
土壤中的羟胺还原酶能将在土壤中氮代谢(亚硝酸盐的还原或者氨的氧 化)过程中形成的中间产物羟胺还原成氨，土壤中的还原态化合物可作为 氢的供体。因此，土壤中羟胺还原酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的氨 挥发损失，间接影响氮肥的利用效率。土壤中羟胺还原酶的活性受土壤条 件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理 措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中羟胺还原酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关羟胺还原酶活性的测定基本都是参照①.x.哈兹耶夫著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》 一书中的方法。该书中所推荐使用的方法为提取液中加入过量的乙酸酐和FeCh,显色机理为被羟胺还原所得的Fe"离子与醋酸酐的羰基作用而显褐色，测定F,离子的浓度，即可间接测定原溶液中羟胺的浓度。其不足之处在于应用此种显色方法所测得的羟胺的浓度较用碘量法所测得的浓度偏低，常形成 较大的系统误差。这可能是由于醋酸酐和Fe"形成配合物时的稳定常数较低所导致。应用此法所测定的羟胺还原酶活性的在测量精确度方面也有所欠 缺。另外，由于涉及到乙酸酐(冰毒前体)的应用，购买乙酸酐需要公安 部门的毒品证明，无形中降低了分析的时效性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检验土壤中羟胺还原酶活性时的显色方 法。该方法是在借鉴前人所应用的显色方法的原理基础上，对羟胺还原酶 活性的测定过程中的显色方法进行了改进。改进后的显色方法较乙酸酐-三 氯化铁法更灵敏、系统误差较小、准确度和精密度更高、显色剂用量更少， 使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现上述目的，本专利技术釆用的技术方案为参照①.X.哈兹耶夫著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活 性》 一书中的方法进行土壤培养，即l)取0. 5-1. 0g风干土壤置于100ml带磨口塞得瓶中，加入10-20mg碳 酸钩，仔细混合均勾；然后加入1-2ml0. 5-1%的盐酸羟胺溶液和1-2mliy。的葡萄糖溶液；在10-12mm水银柱的压力下抽出瓶中空气；将瓶伃细摇匀， 并在30土rC恒温箱中放置5土0Jh;用灭菌土壤加试剂作为对照；在培养 结束后，向瓶中加入50ml蒸馏水和2-3ml锘钾巩饱和溶液，摇均后用致密 滤纸过滤得提取液；2) 取土壤培养后的提取溶液lml于50ml容量瓶中，加入含 Fe3+0. 002-0. Olmol L/'的三价铁盐溶液1-5ml、 0. 8-2. Gg L—'cx - a ，联吡 啶溶液l-5ml，然后用蒸馏水定容至刻度，显色反应在常温下进行，所得溶 液显橙色，显色达到稳定，在520nm下用分光光度计比色测定其吸光值为A;3) 在520腿下比色测定一系列两组或两组以上已知浓度的羟胺溶液 0.00、 0.20、 0.40、 0.60、 0.80、 1. OOg歸H 1 . L—'的吸光值A'，以羟胺 溶液的浓度和测定的吸光值A'制作标准曲线，得到斜率b;4) 根据吸光值A和斜率b,计算提取液中的羟胺浓度S: S=A*b,其中， A为提取液的吸光值，b为标准曲线的斜率；5) 计算样品中的羟胺浓度；6) 计算羟胺还原酶活性,计算公式为:[(S-S) V^/1000V:J/W,单 位mgNH2OH . g—'soil 5h-';式中，S,为对照中的歸H含量(mg . L 1 ); S 为样品中的肌OH含量(mg L"); V!为提取液总体积(ml ); V,为显色时定 容后的溶液体积(ml); 1000为单位转换系数；V3为测定时所取滤液体积， W为称土样重(g)。所述三价铁盐溶液为氯化铁溶液、溴化铁溶液、硫酸铁溶液或硫酸铁铵 溶液均可；所述a-a，联吡啶溶液为cc-cc，联吡啶的乙醇溶液或95°/。乙醇 (5%水)溶液；如果在40min内不能完成吸光值测定，应加入 l-5ml0. 01-0. lmol L-1的KF或NaF溶液作为掩蔽剂以阻止副反应发生。 本专利技术方法改进的依据三价铁盐-联吡啶法的显色机理为铁盐溶液中的F,将溶液中的羟胺氧 化为氮气，而自身被还原为Fe、 Fe2+与加入的oc-a，联吡啶(Dipd)发生 配合反应生成的Fe2+-a-oc，联吡啶配合物显橙色，而过量的cx-a，联吡 啶与剩余Fe^配合生成无色的Fe3+-a-ot，联吡啶配合物，因而可以通过比 色测定Fe"-a-oc'联吡嚏配合物的生成量衡量溶液中羟胺的量。已有研究Fe3++ NH2OH + 3Dipd -Fe(Dipd)32+(橙色)+ 1/2N2+H20 + H+Fe3+ + 3Dipd—— Fe(Dipd)33+ (无色) 指出，在pH为4. 6-6. 6的范围内？62+-(1-cc，联吡啶配合物的吸光度不随 pH值而变化，故本试验将显色pH调节至此范围。Fe3+-a-a，联吡嗖配合物可以经缓慢的光还原作用而转化为Fe2+-a-cc，联吡啶配合物导致羟胺测定浓度偏高。对此，我们可以通过减少显色 时间或通过在待测溶液中加入少量NaF或KF溶液，掩蔽未被还原的Fe"离 子，阻止光还原反应的发生来减小应用此法所造成的系统误差。此种方法的最佳测量浓度为羟胺含量在0. 4-15mg 'L—'范围内，而试验时的羟胺浓度恰好在此范围内。与过去的分析方法相比较，本专利技术的优点主要有1) 所使用的显色方法灵敏度更高，将分析精确度提高了一个数量级。由于羟胺质量浓度在0.4-15ng mr的范围内与吸光度呈良好的线性关系， 故本专利技术所涉及到的显色方法可将结果精确至0. lpg 'ml、而原来方法的 精确度为1. 0 ia g mr，新方法将分析精度提高了 一个数量级。2) 准确度和精密度较高。原来的显色方法由于存在显色机理上的不足， 使应用分光光度法测定的系统误差不可避免。本专利技术在显色过程中应用了 pH调节、加入掩蔽剂等方法，有效地减少了由于显色机理而引起的测量误 差，使检测的准确度和精密度较高。具体实施方式 试剂配制1. 三价铁盐溶液称取氯化铁0. 032-G. 162g或溴化铁0. 059-Q. 296g 或硫酸铁0. 040-0. 200g或十二水合硫酸铁铵0. 096-0. 482g溶于100ml蒸 馏水中即得含Fe3+0. 002-0. Olmol L—1的铁盐溶液。2. cc-oc，联吡嚏溶液称取0. 08-0. 20gcc-a，-联吡啶溶于100ml95°/。乙醇中或无水乙醇中。3. 掩蔽剂称取NaFO. 042-0. 420g或KFO. 058-0. 581g溶于100ml蒸馏水中。标准曲线制备2. 1046g盐酸羟胺溶于1L水中，则得到lg L-'的贮备液。此贮备液需 放入4。C的冰箱中保存，保存时间不宜超过数周。吸取上述标准贮备液lml， 定容至100ml，得到0. Olg . L—'的溶液。再分别吸取该溶液O、 1、 2、 3、 4、 5ml于50ml容量瓶中，所得羟胺溶液浓度为0. 00、 0. 20、 0. 40、 0. 60、 0. 80、 1. OOg歸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种土壤羟胺还原酶活性检测时的显色方法，其特征在于：１）取０．５－１．０ｇ风干土壤置于１００ｍｌ带磨口塞得瓶中，加入１０－２０ｍｇ碳酸钙，仔细混合均匀；然后加入１－２ｍ１０．５－１％的盐酸羟胺溶液和１－２ｍｌ１％的葡萄糖溶液；在１０－１２ｍｍ水银柱的压力下抽出瓶中空气；将瓶仔细摇匀，并在３０±１℃恒温箱中放置５±０．２ｈ；用灭菌土壤加试剂作为对照；在培养结束后，向瓶中加入５０ｍｌ蒸馏水和２－３ｍｌ铝钾矾饱和溶液，摇均后用致密滤纸过滤得提取液；２）取土壤培养后的提取溶液１ｍｌ于５０ｍｌ容量瓶中，加入含Ｆｅ↑［３＋］０．００２－０．０１ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］的三价铁盐溶液１－５ｍｌ、０．８－２．０ｇ.Ｌ↑［－１］α－α’联吡啶溶液１－５ｍｌ，然后用蒸馏水定容至刻度，显色反应在常温下进行，所得溶液显橙色，显色达到稳定，在５２０ｎｍ下用分光光度计比色测定其吸光值为Ａ；３）在５２０ｎｍ下比色测定一系列两组或两组以上已知浓度的羟胺溶液０．００、０．２０、０．４０、０．６０、０．８０、１．００ｇＮＨ↓［２］ＯＨｌ.Ｌ↑［－１］的吸光值Ａ’，以羟胺溶液的浓度和测定的吸光值Ａ’制作标准曲线，得到斜率ｂ；４）根据吸光值Ａ和斜率ｂ，计算提取液中的羟胺浓度Ｓ∶Ｓ＝Ａ＊ｂ，其中，Ａ为提取液的吸光值，ｂ为标准曲线的斜率；５）计算样品中的羟胺浓度；计算羟胺还原酶活性，计算公式为：［（Ｓ↓［１］－Ｓ）Ｖ↓［１］Ｖ↓［２］／１０００Ｖ↓［３］］／Ｗ，单位ｍｇＮＨ↓［２］ＯＨ.ｇ↑［－１］ｓｏｉｌ.５ｈ↑［－１］；式中，Ｓ↓［１］为对照中的ＮＨ↓［２］ＯＨ含量（ｍｇ.Ｌ↑［－１］）；Ｓ为样品中的ＮＨ↓［２］ＯＨ含量（ｍｇ.Ｌ↑［－１］）；Ｖ↓［１］为提取液总体积（ｍｌ）；Ｖ↓［２］为显色时定容后的溶液体积（ｍｌ）；１０００为单位转换系数；Ｖ↓［３］为测定时所取滤液体积，Ｗ为称土样重（ｇ）。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：武志杰，史云峰，陈利军，王殳屹，隽英华，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]