本发明专利技术公开了稳定表达粘蛋白Mgfp‑5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，(1)选取转基因烟草种子，接种于MS固体培养基上培养，得到T1代转基因烟草无菌苗；(2)将步骤(1)中的T1代转基因烟草无菌苗继代培养20d，选取继代培养后的叶片在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；(3)切取步骤(2)中所得的愈伤组织在继代培养基中固体或者悬浮继代培养，得继代愈伤组织。本发明专利技术稳定表达粘蛋白Mgfp‑5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，可以为获得重组蛋白Mgfp‑5的原材料提供新途径，可以拓宽基因工程解决重组蛋白的研究领域，为研究植物表达贻贝粘蛋白提供参考，促进以植物源的重组蛋白Mgfp‑5的生物转化进程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法。
技术介绍
随着生物技术的发展，植物组织培养生产次生代谢物，可以用于植物次生代谢产物的工厂化生产。自从Nickell(1956)第一次证明植物细胞可以象微生物一样进行培养而不断生长一来，以植物培养细胞或者组织为材料生产次生代谢物就迅速发展起来。植物组织培养具有细胞增殖快、培养周期短、材料均一、重复性好、不受季节与环境限制等优点，在烟草组织和细胞培养、基因转化和次生物质生产等已有不少成功报道。贻贝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein，MAP)是海洋软体动物贻贝(Mytilidae)足部的足丝腺分泌的一类具有粘性的蛋白质，也称贻贝足丝蛋白(Mussel Foot Protein,Mfp)，其粘性、防水性及耐腐蚀性强，而且无毒害、无免疫原性且生物相容性好，是一种优质的医学粘附材料。目前足丝盘中的6种贻贝粘蛋白类型中，Mfp-5粘性最强。现用的贻贝粘蛋白主要是天然获取，但是其易固化且含量低，难获得、成本高，制约了其应用。已有用原核表达(大肠杆菌)及真核表达(巴斯德酵母)系统获得基因工程重组的贻贝粘蛋白，但是表达量或者粘附性能均不如意。前期我们将地中海贻贝蛋白Mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5)基因在模式植物烟草中顺利表达，这为重组粘蛋白的研究准备了材料。然而未见到借助烟草组织研究重组蛋白Mgfp-5的报道，并以此为材料关注优质医用粘合剂的研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，为获得重组蛋白Mgfp-5的原材料提供了新途径，可以拓宽基因工程解决重组蛋白的研究领域，为研究植物表达贻贝粘蛋白提供参考，促进以植物源的重组蛋白Mgfp-5的生物转化进程。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，该方法如下：(1)选取转基因烟草种子，接种于MS固体培养基上培养，得到T1代转基因烟草无菌苗；转基因烟草种子为转mgfp-5基因的烟草种子；(2)将步骤(1)中所得的T1代转基因烟草无菌苗继代培养20d，选取继代培养后的叶片在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；(3)切取步骤(2)中所得的愈伤组织在继代培养基中固体或者悬浮继代培养，得继代愈伤组织。进一步地，步骤(1)中的MS固体培养基上附加有20mg/L Kan，且无激素；该愈伤组织诱导培养基包括如下：20mg/L Kan、3％蔗糖(w/v)和0.7％琼脂(w/v)的MS固体培养基(pH 6.0)组成；当固体继代培养愈伤组织时，所述继代培养基包括：固体培养基MS、2,4-D 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、Kan 20mg/L 和蔗糖3％，pH5.8～6.2组成；当液体继代培养愈伤组织时，所述继代培养基包括：液体培养基MS、2,4-D 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、Kan 20mg/L和蔗糖3％组成。进一步地，当固体继代培养愈伤组织时，继代培养基包括：固体培养基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、20mg/L kan和蔗糖3％，pH5.8～6.2组成；当液体继代培养愈伤组织时，该继代培养基包括：液体培养基MS、2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、NAA0.1mg/L、kan 20mg/L和蔗糖3％组成。进一步地，该烟草种子培养的条件为25±2℃，光照强度为30～50mol·m-2·s-1，每天16h/8h光/暗培养；该诱导培养的条件为在25±2℃的温度下，黑暗培养20d。该继代培养的条件为：当固体继代培养愈伤组织时，切取疏松愈伤组织，在固体继代培养基中培养30～33d；当悬浮继代培养愈伤组织时，选取疏松愈伤组织，以接种量5％(m/v)于液体培养基中，25±2℃，100rpm振荡培养20～21d。进一步地，该转基因烟草种子接种前需预处理，预处理过程如下：用75％酒精浸泡转基因烟草种子30s，然后用0.1％升汞(含吐温-80)灭菌8min，无菌水冲洗5次。本专利技术稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法具有如下优点：本专利技术所提供的转mgfp-5基因烟草愈伤组织诱导及培养方法，可以稳定表达粘蛋白Mgfp-5，并且具有细胞增殖快、培养周期短、材料均一、重复性好、不受季节与环境限制等优点，可以为获得重组蛋Mgfp-5的原材料提供新途径，含有Mgfp-5蛋白的愈伤组织的研究可以为植物中的贻 贝粘蛋白表达提供参考，促进以植物源的重组蛋白Mgfp-5的生物转化进程，助力突破重组蛋白Mgfp-5的临床应用的瓶颈。附图说明图1是本专利技术稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法流程示意图；图2是本专利技术中转mgfp-5基因的烟草T1代图；a-b.抗性无菌小苗；c-d.愈伤组织；图3是本专利技术中烟草愈伤组织固体培养生长曲线；图4是本专利技术中烟草愈伤组织悬浮培养倍增曲线；图5是本专利技术中mgfp-5的PCR(A)与RT-PCR(B)分析；图6是本专利技术中mgfp-5蛋白Western blot分析；CK：野生烟草；1-3依次为转基因烟草T1幼叶、固体培养组织和液体培养组织。具体实施方式本专利技术中使用的质粒提取、纯化与胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，cDNA反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司DNA聚合酶、引物由上海生工生物工程有限公司提供和合成，卡那霉素(kanamycin，Kan)购自Sigma公司(美国)，其他试剂均为分析纯。本专利技术中使用的MS基本培养基按手册通用方法配制，组成与含量为：NH4NO31650mg/L，KNO3 1900mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 1700mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，Na2MnO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O 27.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。在本专利技术中，实验材料转mgfp-5基因烟草T1代种子为西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室和西北大学生物技术省级重点实验室鉴定并保存。实施例1本专利技术稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，如图1所示：(1)选取转mgfp-5基因的烟草种子，用75％酒精浸泡30s，用0.1％升汞(含吐温-80)灭菌8min，无菌水冲洗5次，在附加20g本文档来自技高网...
【技术保护点】
稳定表达粘蛋白Mgfp‑5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，其特征在于，该方法如下：(1)选取转基因烟草种子，接种于MS固体培养基上培养，得到T1代转基因烟草无菌苗；转基因烟草种子为转mgfp‑5基因的烟草种子；(2)将步骤(1)中所述的T1代转基因烟草无菌苗继代培养20d，选取继代培养后的叶片在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；(3)切取步骤(2)中所得的愈伤组织在继代培养基中固体或者悬浮继代培养，得继代愈伤组织。
【技术特征摘要】
1.稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，其特征在于，该方法如下：(1)选取转基因烟草种子，接种于MS固体培养基上培养，得到T1代转基因烟草无菌苗；转基因烟草种子为转mgfp-5基因的烟草种子；(2)将步骤(1)中所述的T1代转基因烟草无菌苗继代培养20d，选取继代培养后的叶片在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；(3)切取步骤(2)中所得的愈伤组织在继代培养基中固体或者悬浮继代培养，得继代愈伤组织。2.按照权利要求1所述的稳定表达粘蛋白Mgfp-5的转基因烟草愈伤组织的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的MS固体培养基上附加有20mg/L Kan，且无激素；所述愈伤组织诱导培养基包括如下：20mg/L Kan、3％蔗糖(w/v)和0.7％琼脂(w/v)的MS固体培养基(pH6.0)组成；当固体继代培养愈伤组织时，所述继代培养基包括：固体培养基MS、2,4-D 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.1～0.3mg/L、Kan 20mg/L和蔗糖3％，pH5.8～6.2组成；当液体继代培养愈伤组织时，所述继代培养基包括：液体培养基MS、2,4-D 0.5～1.5mg/L、6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA0.1～0.3mg/L mg/L、Kan20mg/L和蔗糖3％组成。3.按照权利要求2所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王英娟，王睿劼，吕亚维，张雨靖，杨泽熵，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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