一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法，主要是利用胰蛋白酶可以催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐，水解成为N-苯甲酰-L-精氨酸盐酸盐和乙醇的特点，在水解后的反应体系中检测253nm波长处的吸光值，从而测定胰蛋白酶的活性。本发明专利技术设定了最佳反应温度为37℃和最佳检测时间在反应25分钟的时候，获得了一种新的胰蛋白酶活性检测方法，灵敏度更高，从而可用于细胞制品中残留胰蛋白酶活性的检测。因此，本发明专利技术是一种简单、灵敏、实用的检测细胞制品中残余胰蛋白酶活性的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质检测
，更具体的说是涉及一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法。
技术介绍
胰蛋白酶是细胞培养过程中必不可少的一个试剂，用于贴壁细胞的消化，但是，当细胞制品用于人体的时候，其中残余的胰蛋白酶活性对使用者可能造成潜在的危害。因此，应该对细胞制品中残余的胰蛋白酶活性进行检测并限量。胰蛋白酶作为一种蛋白水解酶，对于由碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性；此外还能催化由碱性氨基酸的羧基形成的酰胺键或酯键；因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用的方法，都是针对胰蛋白酶含量比较高的胰蛋白酶制剂，不适合检测微量的胰蛋白酶活性。因此，本专利技术在《中国药典》2010版中关于胰蛋白酶活性测定方法的基础上，专利技术了一种简单、灵敏适合于细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种简单、灵敏的检测细胞制品中残余胰蛋白酶活性的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法，具体包括如下步骤：(1)空白实验：取底物溶液2.5-3.5ml，加入0.001mol/L盐酸溶液150-250μl，混合均匀后，作为空白实验。(2)细胞制品残余胰蛋白酶活性的测定：取细胞制品溶液100μl，加入底物溶液2.5-3.5ml和磷酸盐缓冲溶液80-120μl后，立即计时并混合均匀，并在253nm处测定吸光度OD值A2，同时保持反应体系在36-38℃；然后在反应25分钟的时刻点测定253nm处的吸光度OD值A1；A1-A2代表了制品中残余的胰蛋白酶活性。优选的，在上述一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法中，取底物溶液3.0ml，加入0.001mol/L盐酸溶液200μl，混合均匀后，作为空白实验。优选的，在上述一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法中，取细胞制品溶液100μl，加入底物溶液3.0ml和磷酸盐缓冲溶液100μl后，立即计时并混合均匀，并在253nm处测定吸光度OD值A2，同时保持反应体系在37℃；然后在反应25分钟的时刻点测定253nm处的吸光度OD值A1；A1-A2代表了制品中残余的胰蛋白酶活性。优选的，在上述一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法中，所述磷酸盐缓冲溶液是由0.067mol/L磷酸二氢钾溶液13ml与0.067mol/L磷酸氢二钠溶液87ml混合配置而成的。优选的，在上述一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法中，所述底物溶液的配置：取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg，加水溶解至100ml，作为底物原液；然后以水作空白实验，取10ml底物原液，用磷酸盐缓冲液稀释成100ml后，在253nm的波长处测定吸光度，并可以用底物原液或磷酸盐缓冲液调节，使其吸光度在0.575-0.585之间，底物溶液制备完毕，底物溶液制成后应在2小时内使用。优选的，在上述一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法中，所述底物溶液在恒温于37.0℃±0.5℃的条件下保存和使用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术是利用胰蛋白酶催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐，水解成为N-苯甲酰-L-精氨酸盐酸盐和乙醇，并且水解后的反应体系在253nm波长处的吸光值升高，吸光值的变化在一定范围内与胰蛋白酶的活性成正比，从而检测出胰蛋白酶的活性。本专利技术以BAEE作为胰蛋白酶的作用底物，胰蛋白酶作用于BAEE的酯键，方法简单，并且由于BAEE是一小分子物质，所以反应更加迅速和彻底，可获得较高的灵敏度。由此可知本专利技术检测方法简单，操作方便，反应灵敏度高，与《中国药典》中胰蛋白酶活性检测方法相比，为提高检测的灵敏度，升高了反应温度，延长了反应时间，使细胞制品中微量的残余胰蛋白酶反应更加彻底，胰蛋白酶活性的检测更加准确，从而得到了一种可用于细胞制品中微量胰蛋白酶活性检测的新方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为检测过程中OD值与时间的变化曲线图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例公开了一种简单、灵敏、实用的检测细胞制品中残余胰蛋白酶活性的方法。本专利技术是借鉴《中国药典》2010版中关于胰蛋白酶活性的测定方法，并做了适当改进，从而公开了一种适合于细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法。具体实施例：一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法，具体包括如下步骤：(1)空白实验：取底物溶液2.5-3.5ml，加入0.001mol/L盐酸溶液150-250μl，混合均匀后，作为空白实验。(2)细胞制品残余胰蛋白酶活性的测定：取细胞制品溶液100μl，加入底物溶液2.5-3.5ml和磷酸盐缓冲溶液80-120μl后，立即计时并混合均匀，并在253nm处测定吸光度OD值A2，同时保持反应体系在36-38℃；然后在反应25分钟的时刻点测定253nm处的吸光度OD值A1；A1-A2代表了制品中残余的胰蛋白酶活性。为了进一步优化上述技术方案，取底物溶液3.0ml，加入0.001mol/L盐酸溶液200μl，混合均匀后，作为空白实验；空白实验是用以抵消OD值变化中由于底物自然水解所造成的影响。为了进一步优化上述技术方案，取细胞制品溶液100μl，加入底物溶液3.0ml和磷酸盐缓冲溶液100μl后，立即计时并混合均匀，并在253nm处测定吸光度OD值A2，同时保持反应体系在37℃；然后在反应25分钟的时刻点测定253nm处的吸光度OD值A1；A1-A2代表了制品中残余的胰蛋白酶活性。为了进一步优化上述技术方案，磷酸盐缓冲溶液是由0.067mol/L磷酸二氢钾溶液13ml与0.067mol/L磷酸氢二钠溶液87ml混合配置而成的。为了进一步优化上述技术方案，底物溶液的配置：取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg，加水溶解至100ml，作为底物原液；然后以水作空白实验，取10ml底物原液，用磷酸盐缓冲液稀释成100ml后，在253nm的波长处测定吸光度，并可以用底物原液或磷酸盐缓冲液调节，使其吸光度在0.575-0.585之间，底物溶液制备完毕，底物溶液制成后应在2小时内使用。为了进一步优化上述技术方案，底物溶液在恒温于37.0℃±0.5℃的条件下保存和使用。为了进一步优化上述技术方案，证明本专利技术提供的方法的灵敏度比药典法高，用同一个胰蛋白酶稀释样品，用本专利技术方法与药典法分别多次测定，结果见表1。从表1中可以看出：药典法反应时间为5min，每隔30秒钟读取吸光度，要求每30秒钟吸光度的改变应恒定在0.015-0.018之间，呈线性关系的时间不得少于3分钟；而对于仅含有微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)空白实验：取底物溶液2.5‑3.5ml，加入0.001mol/L盐酸溶液150‑250μl，混合均匀后，作为空白实验。(2)细胞制品残余胰蛋白酶活性的测定：取细胞制品溶液100μl，加入底物溶液2.5‑3.5ml和磷酸盐缓冲溶液80‑120μl后，立即计时并混合均匀，并在253nm处测定吸光度OD值A2，同时保持反应体系在36‑38℃；然后在反应25分钟的时刻点测定253nm处的吸光度OD值A1；A1‑A2代表了制品中残余的胰蛋白酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)空白实验：取底物溶液2.5-3.5ml，加入0.001mol/L盐酸溶液150-250μl，混合均匀后，作为空白实验。(2)细胞制品残余胰蛋白酶活性的测定：取细胞制品溶液100μl，加入底物溶液2.5-3.5ml和磷酸盐缓冲溶液80-120μl后，立即计时并混合均匀，并在253nm处测定吸光度OD值A2，同时保持反应体系在36-38℃；然后在反应25分钟的时刻点测定253nm处的吸光度OD值A1；A1-A2代表了制品中残余的胰蛋白酶活性。2.根据权利要求1所述的一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法，其特征在于，取底物溶液3.0ml，加入0.001mol/L盐酸溶液200μl，混合均匀后，作为空白实验。3.根据权利要求1所述的一种细胞制品中残余胰蛋白酶活性的检测方法，其特征在于，取细胞制品溶液100μl，加入底物溶液3.0ml和磷酸盐缓冲溶液100μl后，立即计时并混合均匀，并在253nm处测定吸光度O...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩忠朝，王斌，冯杰，韩之波，耿洁，
申请(专利权)人：天津昂赛细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12