单细胞水平检测MMP酶活性的方法技术

本发明专利技术提供了一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，包括以下步骤：(a)采用微流控装置，使得细胞溶液和多肽溶液经由两个通道相汇聚后进一步形成微液滴，微液滴中封装有单细胞和多肽，微液滴在连续相的带动下流出，其中多肽溶液中含有可诱导增强酶分泌的分子，多肽的序列包括特异性酶切片段，且首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团；(b)收集微液滴，用荧光显微镜检测信号；(c)根据荧光信号，判断MMP酶活性。本发明专利技术的方法能够高效、灵敏、低成本且在单细胞水平上检测与肿瘤恶性程度、侵入性以及癌转移能力相关的酶活性，从而应用于肿瘤的诊断和治疗，因而具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，该方法可进一步用于判断肿瘤细胞的扩散程度。
技术介绍
恶性肿瘤细胞是指在人体新陈代谢过程中伴随着从原发肿瘤扩散进入人体某些循环系统中的肿瘤细胞，它们的出现标志着肿瘤细胞已经开始从病灶组织向四周扩散，从而导致更多器官组织产生病变。研究表明，约90％的癌症死亡案例与肿瘤细胞扩散有关。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞必须打破它们迁移过程中的生理障碍，而肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)能使细胞外基质(ECM)蛋白水解，这一特点在肿瘤扩散转移过程中起着至关重要的作用。MMPs是靠Zn离子等金属离子作为辅助因子的肽链内切酶家族中的一种，它们在组织重构，降解细胞外矩阵蛋白和基底膜及诱导血管生成等过程发挥作用。MMP，基质金属蛋白酶中的一种白明胶酶，分子量92kDa，它在肿瘤细胞中的高表达和活性将协助肿瘤细胞入侵转移。因此检测MMP酶活性将给评估肿瘤细胞入侵提供重要帮助，传统的检测细胞入侵实验，譬如使用基质膜(matrigel)的方法，模仿细胞外基质，在细胞培养小室中，用基质膜将高营养液的培养基和低营养液的培养基隔开，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液中，最后通过检测高营养液的细胞来探究细胞入侵能力。此外，还有常用的酶联免疫吸附实验，一种抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记检测方法。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检测物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。上述传统方法至少具有如下缺陷：1、实验往往重现性差，过程
冗长、繁琐。2、多数实验往往以群体细胞为实验对象，得到大量细胞表达的平均结果。然而这样的群体细胞检测结果往往会忽略个体细胞间表达的差异。因此急需开发一种高效、灵敏、低成本，且能够在单细胞层次上敏感检测MMP酶活性的微流控方法
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，该方法简便，可重复性好，成本低，可在单细胞水平高灵敏测量与肿瘤恶性程度、侵入性以及癌转移能力相关的MMP酶的活性，进而实现肿瘤的早期诊断和治疗。本专利技术采用了以下技术方案：一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，包括以下步骤：(a)采用微流控装置，使得细胞溶液和多肽溶液经由两个通道相汇聚后进一步形成微液滴，微液滴中封装有单细胞和多肽，且微液滴在连续相的带动下流出，其中多肽溶液中含有可诱导增强酶分泌的分子，该分子用于刺激肿瘤细胞产生MMP酶，多肽的序列包括特异性酶切片段且其序列的首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团；(b)收集微液滴，用荧光分析法检测微液滴，得到荧光信号；(c)根据荧光信号，判断MMP酶活性。进一步地，微流控装置包括具有两个支通道和主通道的Y型套管和与Y型套管的主通道相流体连通的毛细管，毛细管的远离Y型套管的端部呈锥形，细胞溶液和多肽溶液经由Y型套管的两个支通道相汇聚，经过主通道进入毛细管中并在毛细管的锥形端部形成微液滴。微液滴的尺寸为150-250μm，微液滴尺寸可以用进样液体流速调节。在一具体实施例中，微流控装置包括分别具有相流体连通的竖直通道和水平通道的第一T型三通和第二T型三通，且第一T型三通
和第二T型三通的水平通道通过连接毛细管相流体连通。第一T型三通的水平通道内设有第一毛细管，第二T型三通的水平通道内设有第二毛细管，第一毛细管和第二毛细管的外径均小于水平通道的内径，且在第一、第二T形三通的水平通道的两端部处，第一、第二毛细管的外表面与水平通道内表面之间的空隙被密封，第一毛细管和第二毛细管相对的端部间隔一定距离且均呈锥形，第一毛细管的远离第二毛细管的端部与Y型套管的主通道相连接且流体连通。优选地，第一毛细管的锥形端部的开口小于第二毛细管的锥形端部的开口。细胞溶液与多肽溶液从Y型套管的两个支通道汇聚后，经由主通道进入第一毛细管，并在第一毛细管的锥形端部利用表面活性剂的作用和流动剪切力形成微液滴。具体地，第一T型三通和第二T型三通的竖直通道中分别输入连续相，连续相在水平通道与第一、第二毛细管之间的间隙内分别向第一毛细管与第二毛细管之间的微小间隔处流动，并伴随着第一毛细管的锥形端部处微液滴的产生，带动微液滴从第二毛细管流出。在本专利技术的微流控装置中，T型三通和毛细管可以通过商业途径购买，也可以为自制。比如，毛细管可以为自备的烧灼的玻璃毛细管。在一具体实施例中，分散相(细胞溶液和多肽溶液)分别通过注射泵输入Y型套管中。在一具体实施例中，连续相(矿物油溶液)通过注射泵输入T型三通的竖直通道中，并在第一毛细管和第二毛细管之间的空隙处相汇合，用于带动微液滴流出。进一步地，在步骤(a)中，可诱导增强酶分泌的分子选自12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)、血管紧张素、白介素1、白介素2、白介素4、干扰素INF、肿瘤坏死因子-α中的一种或几种。进一步地，在步骤(a)中，特异性酶切片段为-Gly-Met-序列片段。进一步地，在步骤(a)中，细胞溶液由细胞溶于聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)母液制成。PEGDA母液有利于细胞悬浮。优选地，聚乙二醇二丙烯酸酯母液为含有硫酸铵、D-山梨醇和聚乙二醇二丙烯酸酯单体的磷酸盐(PBS)缓冲液。优选地，在步骤(a)中，细胞溶液中细胞的浓度为6×104-6×106个/mL。在一优选实施例中，细胞浓度为6×104个/mL、6×105个/mL、6×106个/mL。在步骤(a)中，还包括对不同细胞浓度的细胞溶液进行试验，以在微液滴中实现单细胞和多肽进行封装的步骤，使得在选定的细胞浓度下，利用本专利技术的微流控装置能够生成封装单细胞和多肽的微液滴。优选地，在步骤(a)中，连续相为矿物油溶液，矿物油溶液中含有表面活性剂。即，细胞溶液和多肽溶液作为分散相，矿物油作为连续相。更优选地，矿物油溶液中的表面活性剂为ABIL EM90，其中ABILEM90的质量分数优选为2％。进一步地，微液滴收集在载玻片或玻璃器皿中。进一步地，在步骤(b)中，使用荧光显微镜检测微液滴，荧光显微镜检测的激发波长为488nm，发射波长为525nm。在0min时，液滴具有微弱荧光，随着时间递增(比如，10min，20min后)，液滴的荧光强度逐渐增强。根据荧光强度，可以判断出MMP酶的活性，从而可进一步判断肿瘤细胞的转移程度，以用于诊断肿瘤相关疾病或判断疾病的治疗效果。在一更具体的实施例中，选用的细胞溶液中细胞浓度为6×105个/mL，多肽溶液中含有质量体积分数为100ng/mL的刺激物PMA，多肽为首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团的9个氨基酸序列的多
肽。优选地，在步骤(a)中，所述荧光基团为FITC、TET、HEX或VIC，淬灭基团为DABCYL、BHQ或TAMRA。进一步地，在步骤(a)中，多肽的序列为FITC-Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-Lys-Cys-DABCYL。在一具体实施例中，在步骤(a)中，多肽溶液由PEGDA母液与多肽、刺激物12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)混合而成，其中多肽的浓度为160μM，刺激物PMA的浓度为100ng/mL。在本专利技术中，利用T型三通和毛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)采用微流控装置，使得细胞溶液和多肽溶液经由两个通道相汇聚后进一步形成微液滴，所述微液滴中封装有单细胞和多肽，所述微液滴在连续相的带动下流出，其中所述多肽溶液中含有可诱导增强酶分泌的分子，所述多肽的序列包括特异性酶切片段且其序列首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团；(b)收集微液滴，用荧光分析法检测微液滴，得到荧光信号；(c)根据荧光信号，判断MMP酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)采用微流控装置，使得细胞溶液和多肽溶液经由两个通道相汇聚后进一步形成微液滴，所述微液滴中封装有单细胞和多肽，所述微液滴在连续相的带动下流出，其中所述多肽溶液中含有可诱导增强酶分泌的分子，所述多肽的序列包括特异性酶切片段且其序列首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团；(b)收集微液滴，用荧光分析法检测微液滴，得到荧光信号；(c)根据荧光信号，判断MMP酶活性。2.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于：在步骤(a)中，所述微流控装置包括具有两个支通道和主通道的Y型套管和与所述Y型套管的主通道相流体连通的毛细管，所述毛细管的远离所述Y型套管的端部呈锥形，所述细胞溶液和所述多肽溶液经由所述Y型套管的两个支通道相汇聚，经过主通道进入毛细管中并在毛细管的锥形端部形成微液滴。3.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于：在步骤(a)中，可诱导增强酶分泌的分子选自12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、血管紧张素、白介素1、白介素2、白介素4、干扰素INF、肿瘤坏死因子-α中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于：在步骤(a)中，所述细胞溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘坚，余钊，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32