合成以X-L-脯氨酸-Y化学结构的底物，用于测定X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶活性。其中X代表氨基酸残基，Y代表对硝基苯胺，对苯基偶氮胺或4-苯偶氮-1-萘胺。这种复合物，满足底物要求的各种条件，例如：易测定（通过酶水解底物）、稳定、底物量和酶含量及底物水解量和孵育时间成线性关系。用这种新的二肽衍生物及盐作为底物，检测X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶活性可以作为一种非常有效的疾病辅助诊断方法，尤其对于一些恶性肿瘤的诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学
，具体涉及一种新的二肽衍生物及盐，以这种二肽衍生物及盐作为底物，可用于酶活性检测。
技术介绍
为了阐明动物体内酶活性与疾病的关系，国内外做了大量的相关研究。有研究报道，酶活性与疾病存在显著相关性，因此酶活性检测可作为一种疾病监测的辅助手段。例如，检测亮氨酸氨基肽酶活性用于区分梗阻性黄疸和肝细胞性黄疸，谷草转氨酶和乳酸脱氢酶活性检测被广泛应用于肝病的诊断。相对于健康人群来说，许多疾病病的样本都可导致这些酶活性偏高。因此，对于特定病的检测，酶活性检测，不具有很高的可信度，需结合其他临床检测数据，作出判断。常规酶活性检测方法中存在的底物稳定性不好、重复性差、不易测定等缺点，本专利技术提供了一种新的二肽衍生物及盐，可用于酶活性检测，为疾病的辅助诊断提供了一种更可信、更安全、更简单的诊断方法。
技术实现思路
本专利技术涉及到一种新的二肽衍生物及盐，以这种二肽衍生物作为底物，用于检测酶活性，更可信、更稳定、更简单。本专利技术的技术方案如下 首先合成了含有X-L-脯氨酸-Y(X :氨基酸残基。Y :对硝基苯胺，对苯基偶氮胺或4-苯偶氮-I-萘胺结构的二肽衍生物及其盐，检测动物体内是否存在一些酶能够水解这些复合物。最后，我们找到一种单纯酶名为χ-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶。这种酶可以把X-L-脯氨酸-Y水解为X-L-脯氨酸和Y_H(即对硝基苯胺，对苯基偶氮胺或4-苯偶氮-I-萘胺。)。各种动物(包括人)体内都有这种酶，人血清中、唾液中以及唾液腺以及不同的结缔组织，例如牛或人牙髓、牙毛囊、齿龈以及大鼠肉芽肿瘤中都含有这种酶。我们用这些二肽衍生物及盐做底物，检测了正常人血清中X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶的活性，发现这种酶在正常人群中酶活性水平几乎相同，但是在青年男性和青年女性中检测结果存在显著差异，在中老年女性与年轻女性中也存在显著差异。同时有肝胆疾病(比如急性或慢性肝炎，肝硬化)的病人血清中该酶活性水平显著升高，而有原发性高血压以及恶性肿瘤，比如实体肿瘤(例如胃癌、胰腺癌、肺癌)以及白血病及恶性毒瘤患者该酶活性显著降低。因此，我们证实，用这种新的二肽衍生物及盐作为底物，检测X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶活性可以作为一种非常有效的疾病辅助诊断方法，尤其对于一些恶性肿瘤的诊断。此外，我们证实目前这种新的二肽衍生物及盐是安全的复合物，无致癌性，同时这种复合物，满足底物要求的各种条件，例如易测定(通过酶水解底物)、稳定、底物量和酶含量及底物水解量和孵育时间成线性关系。二肽衍生物(X-L-脯氨酸-Y) N-端的氨基酸残基(X)，包括任意的氨基酸残基，因为该酶主要作用于第二个氨基酸残基(L-脯氨酸)，而不是针对于N-端的氨基酸残基(X)。N-端的氨基酸残基常从含有15个以上碳原子的氨基酸选取。例如，中性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸。如果这些氨基酸含有不对称C原子，将会出现不同的立体化学结构，有L型，D型，DL型空间构象，通常情况下为L型氨基酸。此外，这些二肽衍生物 作为底物，不但可以以游离形式存在，而且可以酸盐形式存在，而这种形式不会抑制酶活性。例如对甲苯磺酸、盐酸、氢溴酸。因为盐的稳定性更好，用盐做底物是更好的选择。在X-L-脯氨酸-Y中，Y部分，应从含有对硝基苯胺，对苯基偶氮胺或4-苯偶氮-I-萘胺的氨基酸残基中选择。在这几种氨基酸残基中，含对硝基苯胺的残基是更好的选择，因为这种残基与二肽在水中具有相同的溶解度，更稳定，更易合成。针对X-L-脯氨酸-Y的酶活性取决于N-端氨基酸残基(X)差异。X为中性或碱性氨基酸残基时，二肽衍生物最容易被酶水解，相比来说酸性氨基酸不易水解。因此，二肽衍生物X部分为中性或碱性氨基酸残基或酸盐比如对甲苯磺酸盐，更适合作为底物，而碱性氨基酸易潮解。另一方面，二肽衍生物X为甘氨酸残基，在pH8. 7的环境下，具有最高的水解率。X-L-脯氨酸-Y衍生物，在避光条件下较稳定，且水溶性较好。此外，甘氨酸及其酸盐比如盐酸、对甲苯磺酸，相比一些碱性氨基酸来说，不易潮解，更易于实验操作。综上所述，X-L-脯氨酸-Y中，X为甘氨酸或其盐，特别是对甲苯磺酸盐时，是最佳的底物组合选择。新型二肽都有X-L-脯氨酸-Y这样的结构，可很容易地采用肽化学中熟知的方法进行合成。获得这些二肽，既可以采用如下方法，将L-脯氨酸-Y、对应于N端掩蔽-X部分的N端掩蔽-X氨基酸，用类似碳二酰亚胺衍生物的缩合剂耦合为N端掩蔽-X-L-脯氨酸-Y，再脱除掩蔽基团，也可以采用活性酯或者类似的方法。适于N-端氨基酸的掩蔽基团可从熟知的的基团如苄氧酰基、叔-丁氧酰基和叔-戊氧酰基中选用。如果使用的氨基酸具有功能侧基，在对功能侧基进行掩蔽后，这类氨基酸也可获得应用。比如，在将侧链羧基转换为酯基(如苄酯)后，酸性氨基酸即可使用。胍基用一般的掩蔽基团如甲磺酰基、对硝基苄基酰基和2-(异丙氧基酰基)-3，4，5，6-四氯苯甲酰基(尤其前两种)进行掩蔽后，可以使用，而赖氨酸的N端-氨基通常用熟知的掩蔽氨基的基团进行掩蔽，更常用的是与选用于N端-氨基掩蔽相同的掩蔽基团。依据N端掩蔽基团采用熟知的方法消除所获得的N端掩蔽-X-L-脯氨酸-Y的掩蔽基团，以及可能存在的功能侧基的掩蔽基团。非常重要的是，在消除反应中，仅仅消除掩蔽基团而不对其它部分有影响。 也可以通过N端掩蔽-X-L-脯氨酸与Y-H首先耦合来合成目标二肽的衍生物N端掩蔽-X-L-脯氨酸-Y，再消除掩蔽基团。如果希望获得二肽衍生物与酸形成的盐，则可以通过在类似水、醇等介质中将自由的碱与酸相接触来制备。如果掩蔽基团是类似叔-丁氧酰基这样可以被酸消除的掩蔽基团，将N端掩蔽的衍生物与相同的酸接触，则可以直接获得期望的盐。X-L-脯氨酸-Y和盐，可通过化学合成方法，很易合成。在各种酸盐中，甲苯磺酸盐是最佳选择，这是由于苯磺酸盐可形成含少量杂质稳定的晶体，介于此，可通过简单的重结晶的方法，得到较高纯度的苯磺酸盐。用这种二肽衍生物或盐作为底物检测酶活性是非常容易的。X-L-脯氨酸-Y的水溶液或盐溶液首先应有一个合适的浓度。因为需要相对较长的时间溶解底物，因此需要加入一些其它合适的物质助溶，例如非离子去污剂、酸、醇，或者通过把底物冻干的等方法，让底物形成多孔结构，以增加其溶解性。冻干粉更方便日常使用。根据采用的底物种类，底物溶液最佳pH的选择也不同，但一般根据实验具体要求决定。最佳的pH —般选在6-9之间，建议取在PH 7. 5-8. 9之间。pH大于9. 5，底物自发水解，但是底物溶液，特别是甘氨酰-L-脯氨酸对硝基苯胺溶液在大于上述提到的最佳pH区间内仍较稳定。4°C可保存一周以上，不降解。Y-H的量很容易通过检测特定波长，酶促反应的吸光度来计算。Y-H，即对硝基苯胺385nm处检测,对苯基偶氮胺493nm检测,4-苯偶氮_1_萘胺532nm检测。这种吸光度测定方法非常简单、方便、准确，适合于常规酶活性检测。如果Y-H为对硝基苯胺，酶活性也可通过在酸性条件下对硝基苯胺与过量亚硝酸钠反应形成重氮盐来检测。发生重氮化的对硝基苯胺的量，可通过直接检测未反应的亚硝 酸钠的量来计算，但是一般通过所谓的重本文档来自技高网...
【技术保护点】
二肽衍生物为如下结构：X？L？脯氨酸？？Y，其中X可从以下氨基酸的残基中选取：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸、、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸；Y可以从以下化合物中选取：对硝基苯胺、对苯基偶氮胺、4？苯偶氮？1？萘胺和二肽衍生物的酸性盐类。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟琛，
申请(专利权)人：北京华宇亿康生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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