一种稳定性好的检测幽门螺杆菌抗原试剂盒的制备方法技术

本发明专利技术属于体外诊断试剂生物检测技术领域，具体涉及一种稳定性好的测定粪便幽门螺杆菌抗原的胶乳免疫比浊试剂盒的制备方法。所述试剂盒包括反应缓冲液、交联有幽门螺杆菌抗体的胶乳颗粒和校准品。本发明专利技术的试剂盒通过交联在胶乳颗粒上的幽门螺杆菌抗体与处理过的样本中特异性抗原结合而产生浊度，浊度的上升与样本中幽门螺杆菌抗原的浓度成正比。与现有技术相比，本发明专利技术所述试剂盒的配制方法使其具有更好的稳定性，并且适用于各类生化分析仪，使用简便、灵敏度高、特异性强，适用于任何患者。相对于幽门螺杆菌抗体检测，幽门螺杆菌抗原检测更为准确，具有更高的临床意义。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定性好的检测幽门螺杆菌抗原试剂盒的制备方法
本专利技术涉及一种体外诊断试剂盒，具体涉及一种采用胶乳免疫比浊法定量检测幽门螺杆菌抗原的试剂盒。本专利技术属于生物检测

技术介绍
幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，HP）是一种呈现螺旋形态的轻微厌氧菌，需要非常严格的生长条件。1983年，它首次成功地从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离出来，是目前研究中所知的唯一可以在动物胃中存活的一类微生物。幽门螺杆菌属于革兰氏阴性杆菌，种类丰富，包括胃螺杆菌、拉普尼螺杆菌、犬幽门螺杆菌、黑氏螺杆菌和萨洛莫尼螺杆菌等类型。幽门螺杆菌生活在人体胃幽门处，是最常见的细菌病原体之一。幽门螺杆菌感染所导致的病症包括胃炎、消化道溃疡和淋巴增生性胃淋巴瘤等，严重的会发生病变，最终形成胃癌。2017年10月27日，国际癌症研究机构（IARC）将幽门螺杆菌添加至致癌物清单中，胃癌是癌症死亡的第二大原因。世界上有一半以上的人曾经或正在经受幽门螺杆菌的侵袭，而在某些国家90%的公民几乎都感染过这种病菌。50%左右0-5岁的人都会感染幽门螺杆菌，最初会导致人体发生慢性胃黏膜炎性病变，随后引起胃溃疡和胃萎缩，严重的则会发展成胃癌。幽门螺杆菌寄生于胃粘膜组织中，95%的十二指肠溃疡和67%-80%的胃溃疡是由其引起的。因此，专家认为，尽早发现幽门螺杆菌感染并治疗对预防胃癌具有重要意义。随着医疗技术的不断发展，诞生了多种检测幽门螺杆菌的方法。主要包括以下方法。一、侵入性检测方法这种检测方法主要是依赖胃镜提取活组织进行检查，包括组织学检查、细菌培养、快速尿素酶试验（RUT）、幽门螺杆菌基因检测，如聚酶链式反应（PCR）、寡核苷酸探针杂交等。二、非侵入性检测方法与侵入性检测方法相比，这种检测方法不需要采集胃活检组织，避免了因其所导致的感染及给患者带来的疼痛，临床应用比较广泛，具有快速、廉价、易操作等优点，但是检测的精确度容易受到多种因素的影响。非侵入性检测方法包括13C或14C尿素呼气试验（UBT）、粪便幽门螺杆菌抗原检测、血清学检查等。传统幽门螺杆菌的检测方法自动化程度低且耗时长。因此，提供一种简便快捷且能特异性检测人体中幽门螺杆菌的方法成为迫切需要。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于胶乳免疫比浊法原理的检测试剂盒以测定人体中幽门螺杆菌抗原含量。该试剂存放稳定性得到显著延长，并且适用于各种类型半自动和全自动生化分析仪，同时具有使用操作简便快捷、灵敏度高及特异性强的特点。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于测定幽门螺杆菌抗原的基于胶乳免疫比浊法原理的试剂盒，其特征在于包括：试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、电解质、反应增强剂和防腐剂，作用是提供本专利技术试剂与样本反应的最佳环境。试剂R2包括被幽门螺杆菌抗体包被的胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂，作用是为胶乳颗粒提供一个稳定的反应环境。校准品包括幽门螺杆菌抗原、缓冲液、防腐剂和稳定剂。所述试剂R1中反应缓冲液选自：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液或DIPSO缓冲液中的一种，优选MES缓冲液，缓冲液的pH为6.0-9.0之间，优选pH为7.3，缓冲液的浓度在100-300mmol/L之间，优选200mmol/L。所述试剂R1中稳定剂选自：小牛血清、牛血清白蛋白、蔗糖、EDTA或丙三醇中的一种，优选牛血清白蛋白，稳定剂质量浓度在0.2%-5.0%之间，优选1.0%。所述试剂R1中表面活性剂选自：Tween20、Tween80、Span40、Span80、TritonX-100中的一种，优选Tween80，质量浓度在0.1%-5.0%之间，优选1.0%。所述试剂R1中电解质选自：氯化钠、氯化钾或碳酸钠中的一种，优选氯化钾，电解质质量浓度在1.0%-10.0%之间，优选3.0%。所述试剂R1中反应增强剂选自：PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000中的一种，优选PEG-6000，反应增强剂质量浓度在1.0%-10.0%之间，优选2.0%。所述试剂R1中防腐剂选自：叠氮钠、叠氮锂、亚硝酸钠中的一种，优选叠氮钠，质量浓度在0.02％-0.5％之间，优选0.1％。所述试剂R2中反应缓冲液选自：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液或DIPSO缓冲液中的一种，优选MES缓冲液，缓冲液的pH为6.0-9.0之间，优选pH为7.5，缓冲液的浓度在100-300mmol/L之间，优选200mmol/L。所述试剂R2中胶乳颗粒是具有核壳结构的聚苯乙烯纳米微球。所述试剂R2中胶乳颗粒粒径在50-200nm之间，优选130nm。所述试剂R2中胶乳颗粒质量浓度在0.1%-0.5%之间，优选0.3％。所述试剂R2中幽门螺杆菌抗体选自：幽门螺杆菌全菌体蛋白抗体、热休克蛋白（HspB）、幽门螺杆菌黏附素（HpaA）、细胞毒素相关蛋白（CagA）、尿素酶B亚单位（UreB）、空泡毒素（VacA）、鞭毛蛋白A亚单位（FlaA）和B亚单位（FlaB）中的一种，优选尿素酶B亚单位（ureB)。所述试剂R2中幽门螺杆菌抗体浓度在50-500mg/L之间，优选100mg/L。所述试剂R2中稳定剂选自：小牛血清、牛血清白蛋白、蔗糖、EDTA或丙三醇中的一种，优选牛血清白蛋白，稳定剂质量浓度在0.2%-5.0%之间，优选0.5%。所述试剂R2中防腐剂选自：叠氮钠、叠氮锂、亚硝酸钠中的一种，优选叠氮钠，质量浓度在0.02％-0.5％之间，优选0.1％。所述校准品中缓冲液选自：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液或DIPSO缓冲液中的一种，优选MES缓冲液，缓冲液的pH为6.0-9.0之间，优选pH为7.3，缓冲液的浓度在20-100mmol/L之间，优选50mmol/L。所述校准品中稳定剂选自：小牛血清、牛血清白蛋白、蔗糖、EDTA或丙三醇中的一种，优选牛血清白蛋白，稳定剂质量浓度在0.2%-5.0%之间，优选1.0%。所述校准品中防腐剂选自：叠氮钠、叠氮锂、亚硝酸钠中的一种，优选叠氮钠，质量浓度在0.02％-0.5％之间，优选0.1％。所述校准品中至少包含两个浓度的幽门螺杆菌抗原，例如包含至少5个浓度的幽门螺杆菌抗原，包括但不限于1.5ng/mL、3ng/mL、6ng/mL、24ng/mL、48ng/mL。与现有采用一步法制备的胶乳免疫比浊法的试剂盒相比，本专利技术采用换液法对试剂R2进行配制，使其具有更优的稳定性与特异性，操作步骤如下：步骤1：以MES缓冲液分散胶乳颗粒，之后用EDC活化15min，形本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定性好的幽门螺杆菌抗原检测试剂盒，其特征在于包含试剂R1、试剂R2和校准品：其中，试剂R1包含缓冲液、稳定剂、表面活性剂、电解质、反应增强剂和防腐剂；试剂R2包含被幽门螺杆菌抗体包被的胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种稳定性好的幽门螺杆菌抗原检测试剂盒，其特征在于包含试剂R1、试剂R2和校准品：其中，试剂R1包含缓冲液、稳定剂、表面活性剂、电解质、反应增强剂和防腐剂；试剂R2包含被幽门螺杆菌抗体包被的胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述的抗体是通过换液法偶联于所述乳胶颗粒表面，包括如下步骤：
S1：以MES缓冲液分散胶乳颗粒，之后用EDC活化15min，形成带有羧基官能团的胶乳颗粒；
S2：以12000rpm/min进行离心，15min后收集沉淀，分散胶乳颗粒，以上步骤重复3次；
S3：加入幽门螺杆菌抗体，37℃搅拌反应1h；
S4：加入封闭液，继续搅拌反应1h；
S5：以10000rpm/min进行离心，20min后收集沉淀，去除上清液，以储存液进行洗涤分散，即得包被幽门螺杆菌抗体的胶乳颗粒。


3.根据权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体选自幽门螺杆菌全菌体蛋白抗体、热休克蛋白（HspB）、幽门螺杆菌黏附素（HpaA）、细胞毒素相关蛋白（CagA）、尿素酶B亚单位（UreB）、空泡毒素（VacA）、鞭毛蛋白A亚单位（FlaA）和B亚单位（FlaB）中的一种，在试剂中的浓度为50-500mg/L。


4.根据权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于，所述胶乳颗粒为聚苯乙烯纳米微球，粒径为50-200nm。


5.根据权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娇，孟琛，孙小芳，
申请(专利权)人：北京华宇亿康生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11