一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。本方法利用金葡菌表面的A蛋白可与IgG的Fc片段特异性结合的原理，结合噻唑蓝(MTT)染色法，快速鉴定牛奶样品中的金葡菌。首先将IgG交联在琼脂糖微球上，进而与牛奶共孵育。经过短暂培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色。如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。该方法操作简单，检测特异性强，检测灵敏度高，对金葡菌的最低检测限介于50CFU/mL牛奶和5×10

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法
本专利技术涉及金葡菌检测领域，具体涉及一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。
技术介绍
乳腺炎(mastitis)是泌乳奶牛最常见的疾病之一，不仅引起产奶量降低和用药成本增加，甚至可导致奶牛泌乳机能丧失而被迫淘汰，给奶牛业带来巨大经济损失。引起乳腺炎的病原菌种类繁多，其中革兰氏阴性菌以大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌为主，革兰氏阳性菌以金黄色葡萄球菌为主。通常情况下，大肠杆菌等革兰氏阴性菌感染可引起乳腺发生强烈的免疫炎症反应，受感染的乳腺可自然痊愈。相反，金葡菌则通常引起慢性乳腺感染，导致乳腺发生严重病变。此外，作为一种兼性胞内菌，金葡菌可逃避抗生素的治疗作用，采用抗生素治疗通常难以奏效。再者，金葡菌具有很强的传染性，可通过多种途径在牛群中传播。迄今，针对金葡菌的疫苗尚未研制成功。因而，要有效防控金葡菌性乳腺炎，必须做到早诊断、早隔离。临床上常用的乳腺炎诊断方法有加州乳腺炎检测法(Californiamastitistest,CMT)、牛奶体细胞直接计数法、N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)或乳酸脱氢酶(LDH)检测法等。虽然这些方法可用于判定乳腺是否发生炎症，但均无法明确引起乳腺炎的病原。要明确病原，就必须进行细菌分离培养，并对病原菌进行鉴定。但常规细菌分离培养耗时长，也不适合大规模筛查。鉴于金葡菌性乳腺炎的严重危害，临床上急需一种操作简单、耗时较短、灵敏可靠的微生物学检测法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。该方法利用金葡菌A蛋白可与IgG特异性结合的特点，将IgG交联在琼脂糖微球上，利用IgG-琼脂糖凝胶捕获牛奶样品中的金葡菌，经过短暂培养后，采用传统MTT显色法指示是否存在金葡菌。本技术方案中利用琼脂糖微球具有较大的比表面积这一特点，实现对牛奶中痕量细菌进行有效捕获。一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：1)制备琼脂糖微球；2)将IgG交联在琼脂糖微球上；3)将交联有IgG的琼脂糖微球加入到待检测牛奶样品中，经过培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色，如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。步骤1)中，所述的琼脂糖微球的制备包括：(1.1)水相配置：将琼脂糖加入含NaCl的生理盐水中，微波加热至溶液变澄清，置80℃～95℃水浴保温以去除气泡，得到水相；步骤(1.1)中，所述的水相中琼脂糖质量分数为1％～4％，进一步优选为2％；所述的含NaCl的生理盐水中NaCl的质量分数为0.3％～2％，进一步优选为0.9％。进一步优选，置90℃水浴保温以去除气泡。(1.2)油相配置：配置含Span80的液体石蜡，搅拌均匀后，加热至60℃～80℃，得到油相。步骤(1.2)中，所述的油相中Span80的体积百分数为1％～5％，为3％。加热至65℃～75℃，最优选，加热至70℃。(1.3)将水相和油相按体积比1：4～8混合，3000～5000rpm乳化5～20min，乳化过程在50℃～70℃水浴锅中进行；步骤(1.3)中，将水相和油相按体积比1：5～7混合，进一步优选，将水相和油相按体积比1：6混合。4000rpm乳化10min。乳化过程在60℃水浴锅中进行。(1.4)乳化完成后，将乳化产物置于2～8℃环境中保持5～15min。步骤(1.4)中，将乳化产物置于4℃环境中保持10min。(1.5)乳化产物依次用去离子水离心、体积百分数10％～30％乙醇水溶液和无水乙醇各洗涤2次；步骤(1.5)中，作为优选，体积百分数15％～25％乙醇水溶液，离心条件为1900g，4℃，5分钟。(1.6)沉淀经筛网过滤，收集琼脂糖微球，保存于50％乙醇中备用。步骤(1.6)中，沉淀经100μm筛网过滤。将IgG交联在琼脂糖微球上，具体包括：(2.1)取琼脂糖微球，用去离子水离心洗涤；步骤(2.1)中，用去离子水离心洗涤1～3次(优选为2次)，离心洗涤的条件为2500g，5min/次。(2.2)将洗涤后的琼脂糖微球加入含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中，置摇床中震摇。步骤(2.2)中，含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中碳酸钠的浓度为0.2～0.9M(优选为0.5M)，含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液中环氧氯丙烷的质量百分数为2％～8％(优选为5％)。含环氧氯丙烷的碳酸钠水溶液的pH＝9～10，优选为9.5。置摇床中震摇1h～3h，最优选为2h。(2.3)震摇后，用去离子水洗涤琼脂糖微球，再用碳酸钠水溶液洗涤。步骤(2.3)中，碳酸钠水溶液的浓度优选为0.2～0.8mol/L，优选为0.5mol/L。碳酸钠水溶液的pH＝9～10，优选为9.5。再用0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)洗涤1次，离心条件为2500g，每次洗涤5min。(2.4)将IgG抗体溶于PBS中，配成浓度为2.7～3.7mg/mLIgG的PBS溶液，以0.2～0.8M碳酸钠溶液为缓冲液，透析2～4h，得到纯化的IgG溶液；步骤(2.4)中，将IgG抗体溶于PBS中，配成浓度为3.2mg/mLIgG的PBS溶液，以0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)为缓冲液，室温透析3h，得到纯化的IgG溶液。(2.5)将步骤(2.3)得到的琼脂糖微球与纯化的IgG溶液混合，震摇18h～30h，得到IgG-琼脂糖微球；步骤(2.5)中，震摇22h～26h，震摇24h。(2.6)将IgG-琼脂糖微球(交联有IgG的琼脂糖微球)用去离子水洗涤，加入含乙醇胺的碳酸钠水溶液中作用1～3h去除非特异性吸附，PBS洗涤5次，完成IgG交联在琼脂糖微球。步骤(2.6)中，所述的含乙醇胺的碳酸钠水溶液中乙醇胺的质量百分数为6％～10％。所述的含乙醇胺的碳酸钠水溶液中碳酸钠的浓度为0.2～0.8M，进一步优选为0.5M。将IgG-琼脂糖微球(交联有IgG的琼脂糖微球)用去离子水洗涤3次(2500g、5min/次)，加入含8.5％乙醇胺的0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)中作用2h以消除非特异性吸附，PBS洗涤5次，保存于0.5M碳酸钠溶液(pH＝9.5)中备用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术方法利用金葡菌A蛋白可与IgG特异性结合的特点，将IgG交联在琼脂糖微球上，利用IgG-琼脂糖凝胶捕获牛奶样品中的金葡菌，经过短暂培养后，采用传统MTT显色法指示是否存在金葡菌。本技术方案中利用琼脂糖微球具有较大的比表面积这一特点，实现对牛奶中痕量细菌进行有效捕获。本检测技术操作简单，检测耗时短，检测特异性强(只针对金葡菌)、灵敏性高(最低检测限介于50～5×102CFU/mL之间)，不需要昂贵的仪器设备，并可实现高通量牛奶样品检测。该技术有效克服了现有技术方法的局限，检测人员可轻松进行操作并判定结果。本专利技术方法利用金葡菌表面的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)制备琼脂糖微球；/n2)将IgG交联在琼脂糖微球上；/n3)将交联有IgG的琼脂糖微球加入到待检测牛奶样品中，经过培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色，如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备琼脂糖微球；
2)将IgG交联在琼脂糖微球上；
3)将交联有IgG的琼脂糖微球加入到待检测牛奶样品中，经过培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色，如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。


2.根据权利要求1所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的琼脂糖微球的制备包括：
(1.1)水相配置：将琼脂糖加入含NaCl的生理盐水中，微波加热至溶液变澄清，置80℃～95水浴保温以去除气泡，得到水相；
(1.2)油相配置：配置含Span80的液体石蜡，搅拌均匀后，加热至65℃～85℃，得到油相；
(1.3)将水相和油相按体积比1：2～6混合，2000～4000rpm乳化5～20min，乳化过程在50℃～70℃水浴锅中进行；
(1.4)乳化完成后，将乳化产物置于2～8℃环境中保持5～15min；
(1.5)乳化产物依次用去离子水离心、体积百分数10％～50％乙醇水溶液和无水乙醇洗涤；
(1.6)沉淀经筛网过滤，收集琼脂糖微球。


3.根据权利要求2所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(1.1)中，所述的水相中琼脂糖质量分数为1％～5％。


4.根据权利要求2所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(1.2)中，所述的油相中Span80的体积百分数为1％～4％。


5.根据权利要求2所述的快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(1.3)中，将水相和油相按体积比1：2～6混合。


6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭勋，任炜佳，李丹月，柴娟，应易恬，杨璟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33