一种检测RBD和NTD中和抗体的方法及产品技术

本发明专利技术涉及抗体检测领域，具体涉及相关抗体的双重竞争检测方法及检测组件和应用，可应用于新冠病毒(SARS‑CoV‑2)中和抗体的检测方法和产品中，能够同时检测RBD和NTD中和抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种检测RBD和NTD中和抗体的方法及产品
本专利技术涉及抗体检测领域，具体而言，涉及检测方法及产品。
技术介绍
国内散点突发事件频发，疫苗快速批准上市显得格外迫切。目前已有部分疫苗在全球范围内获得紧急使用授权或附加条件上市。但是面对全新的病毒，相关的基础研究较多机制研究不透彻的背景下，大量的疫苗设计快速进入临床，在疫苗的有效性、保护周期、质量控制、可及性上仍在有较多的内容需要进一步研究。国内第一批疫苗主要为灭活疫苗，然而灭活疫苗采用的BPL灭活，Spike蛋白存在较高比例的融合后构象以及RBD“down”构象，在初步的免疫人群分析中，发现总抗体水平应答相对较低且中和抗体滴度不高的迹象。另外，从现有的新冠基础研究来看，并非所有个体感染新冠之后会产生足够滴度的中和抗体，存在二次感染风险。中和抗体滴度在1个月达到峰值后会逐步下降，少部分低滴度康复者会降至检测限以下。参考其他冠状病毒，新冠抗体存在的时间可能在1-2年左右，并不能形成长效保护。SARS-CoV-2的中和抗体可以通过阻断或抑制SARS-CoV-2与宿主细胞之间的相互作用来有效的控制感染。其中研究最为透彻的机制为SARS-CoV-2刺突Spike蛋白S1亚基上的受体结合区(ReceptorBindingDomain,RBD)和宿主细胞受体ACE2的相互作用及后续的构象转变及膜融合。ACE2又称ACEH，名为血管紧张素转化酶2，是一种金属蛋白酶，全长805个氨基酸，是具有单一胞外催化结构域的I型跨膜糖蛋白。受体结合基序(RBM)，是与ACE2接触的受体结合域(RBD)的一部分。目前研究也分离到很多新的中和抗体，例如结合S1亚基NTD区域的中和抗体。目前部分疫苗显示出免疫后中和抗体阳转率和滴度偏低的迹象。此外，SARS-CoV-2作为RNA病毒，变异频率非常高，恢复期血清和疫苗的中和效果对部分突变显示出更低的中和能力，这部分突变的积累可能导致免疫逃逸的发生。因此对中和抗体检测的灵敏度和敏感性提出了更高的要求。现有的产品主要通过RBD-ACE2竞争法检测阻断RBD-ACE2相互作用的中和抗体，对NTD中和抗体抗体无法检出。为此，提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术提供了以下至少一种实施方式：在一些实施方式中，本专利技术涉及一种冠状病毒中和抗体检测方法，包括步骤：(1)样品与含RBD的片段、试剂1、试剂2接触；试剂1：ACE2或ACE2片段；试剂2：结合NTD的中和抗体；其中，所述试剂1或试剂2中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；(2)检测信号。在一些实施方式中，所述接触方式包括以下任意一种：(a)样品同时与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1、试剂2接触；(b)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1接触，再与试剂2接触；(c)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂2接触，再与试剂1接触；(d)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1、试剂2接触；(e)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1接触，再与试剂2接触；(f)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂2接触，再与试剂1接触。在一些实施方式中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2或SARS-CoV。在一些实施方式中，所述样品选自可能含有抗体的任何样品。在一些实施方式中，所述样品选自血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液或淋巴细胞。在一些实施方式中，含有RBM及NTD结构域的蛋白可选的是S1蛋白或S蛋白。在一些实施方式中，一种冠状病毒中和抗体的检测组件，包括：(a)以上任一实施方式所述的含RBD的片段；(b)以上任一实施方式所述的试剂1；(c)以上任一实施方式所述的试剂2。在一些实施方式中，固相载体选自磁微粒或Elisa板。在一些实施方式中，一种冠状病毒中和抗体的检测组件，包括：有RBM及NTD结构域的蛋白以及试纸；所述试纸上有样本垫、结合垫、层析膜、吸水垫以及背衬板，所述试纸还包括：以上任一实施方式所述的试剂1和试剂2。其中，所述试剂1连接有标记物，并设于结合垫上，所述试剂2固定于层析膜；或；所述试剂2连接有标记物，并设于结合垫上，所述试剂1固定于层析膜。在一些实施方式中，所述含有RBM及NTD结构域的蛋白设于样品垫上。在一些实施方式中，以上任一实施方式所述的检测方法、以上任一实施方式所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。附图说明图1示出双竞争检中和抗体方法学原理，图中M表示固相载体，NTD-NAb表示NTD中和抗体，RBD-NAb表示RBD中和抗体。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。本文中，“中和抗体”中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。本文中，“样品”可理解为可能含有抗体的任何样品，在一些实施方式中，样品来自于感染或主动免疫后的样品；在一些实施方式中，样品选自体液、排泄物、细胞；例如血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液、淋巴细胞等，但不限于此。本文中，“标记物”可理解为能够直接产生信号；或直接或间接促发特定物质产生信号，标记物可直接或间接连接至被标记物上。例如通常用于免疫检测的标记物，包括金属粒子、荧光标记物、发色团标记物、电子致密标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物、放射性标记物、核酸标记物、多肽标记物或酶，但不限于此。在一些实施方式中，标记物可以是胶体金、荧光素、荧光微球、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶乳微球、三联钌、鲁米诺类、Eu螯合物。本文中，“固相载体”可理解为能够与被固定物(如蛋白、多肽)固定，例如通常用于免疫检测的固相载体，包括塑料、微粒或膜载体。塑料例如可以是聚苯乙烯；微粒例如可以是磁微粒；膜载体例如可以是硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。本文中，“检测信号”可理解为采取能够识别信号物质的方式，获取或识别检测信号强弱或水平。本文中，“接触”可理解为允许其发生结合。接触时间不作具体限定，不同的实施方式和检测平台，接触时间有所差异，但属于本领域技术人员可以理解的范畴。本文中，“含有RBM及NTD结构域的蛋白”可以理解为由重组技术构建的仅有RBM和NTD氨基酸组成的重组蛋白，也可以是冠状病毒上的天然蛋白或重组的天然蛋白，其中包括RBM和NTD的氨基酸序列，例如S1蛋白或S蛋白。...

【技术保护点】
1.一种冠状病毒中和抗体检测方法，包括步骤：/n(1)样品与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1、试剂2接触；/n试剂1：ACE2或ACE2片段；/n试剂2：结合NTD的中和抗体；/n所述试剂1或试剂2中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；/n(2)检测信号。/n

【技术特征摘要】
20210113 CN 20211004509971.一种冠状病毒中和抗体检测方法，包括步骤：
(1)样品与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1、试剂2接触；
试剂1：ACE2或ACE2片段；
试剂2：结合NTD的中和抗体；
所述试剂1或试剂2中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；
(2)检测信号。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)选自以下方式中的任意一种：
(a)样品同时与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1、试剂2接触；
(b)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1接触，再与试剂2接触；
(c)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂2接触，再与试剂1接触；
(d)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1、试剂2接触；
(e)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1接触，再与试剂2接触；
(f)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂2接触，再与试剂1接触。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，冠状病毒选自SARS-CoV-2或SARS-CoV。


4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，样品选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏良雨，谢洋洋，刘江武，代双，李俊，向海军，郝明，黄慧，郭伟芸，范名俊，
申请(专利权)人：广东菲鹏生物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44