一种检测末端转移酶活性的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测末端转移酶活性的方法及试剂盒，涉及分子生物学技术领域。本发明专利技术提供的检测方法可以真实准确的检测逆转录酶的末端转移酶活性，进而更为真实准确地反映逆转录反应的模板转换效率，进而为细胞mRNA被捕获的效率提供科学准确的评价。本发明专利技术提供的方法适用于逆转录体系的调试，操作步骤简单、成本低、且检测周期短，可以满足大规模检测的需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学，具体而言，涉及一种检测末端转移酶活性的方法及试剂盒。

技术介绍

1、rna逆转录反应的模板转换效应是指整个逆转录过程中，逆转录酶先以rna为模板进行延伸，随后利用其末端脱氧核糖核苷酸转移酶(tdt)活性将以rna为模板的延伸切换至以dna为模板的延伸。这个过程主要是利用逆转录酶的三大活性：(1)以rna为模板的dna聚合活性；(2)末端脱氧核糖核苷酸转移酶(tdt)活性；(3)以dna为模板的dna聚合活性。其中tdt活性是影响模板转换效应最关键的因素。tdt活性是指无需模板即可在合成产物的3′末端添加几个核苷酸的能力。在特定的条件下，逆转录酶可以展现出tdt活性，如m-mlv逆转录酶会优先在扩增子的3′末端添加胞嘧啶。而逆转录反应中，逆转录酶产生模板转换效应的原理是：逆转录酶先以mrna为模板，延伸其5′末端之后，利用逆转录酶的tdt活性在延伸产物的3′末端添加几个胞苷酸，这几个胞苷酸便可以和3′末端带有对应数量鸟苷酸的模板转换寡核苷酸(template-switching oligo，tso)进行退火，从而延伸产物便能以tso本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种检测末端转移酶活性的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(a)中逆转录引物为茎环逆转录引物或Poly T逆转录引物；

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(c)得到的cDNA产物需要稀释10-100倍以用于所述步骤(d)的qPCR反应；

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述qPCR反应过程中，所述正向外引物的终浓度为0.3-0.5μM，所述正向内引物的终浓度为0.3-0.5μM，所述反向引物的终浓度为0.3-0.5μM，所述探针的终浓度为0.1-0.3μM；

>5.根据权利要求1...

【技术特征摘要】

1.一种检测末端转移酶活性的方法，其中，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(a)中逆转录引物为茎环逆转录引物或poly t逆转录引物；

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(c)得到的cdna产物需要稀释10-100倍以用于所述步骤(d)的qpcr反应；

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述qpcr反应过程中，所述正向外引物的终浓度为0.3-0.5μm，所述正向内引物的终浓度为0.3-0.5μm，所述反向引物的终浓度为0.3-0.5μm，所述探针的终浓度为0.1-0.3μm；

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述逆转录酶为降低或去除了rnase活性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖泽涛，钟淑瑶，章瑞程，王慧，张超，杨容青，
申请(专利权)人：广东菲鹏生物有限公司，
类型：发明
国别省市：

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