【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫，具体涉及一种用于调节nk细胞数量的msc滋养层细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、nk细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)来源于骨髓，分布于骨髓、外周血、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结，是机体内除t细胞及b细胞外的第三类淋巴细胞。nk细胞不需要特异性抗原刺激即可识别并杀伤肿瘤细胞及病毒感染的靶细胞。因此，在临床上，特别是在肿瘤免疫治疗中，其具有独特的优势。然而，由于外周血中的nk细胞数量有限，且体外培养体系不成熟，nk细胞的临床应用迄今为止没有大的突破。
3、现有的nk细胞的体外培养方法包括因子诱导法、滋养层细胞诱导法等。其中，因子诱导法为将外周血单个核细胞中的nk细胞培养于普通淋巴细胞培养基中，并加入细胞因子，但该方法生产成本较高；而滋养层细胞诱导法则是一种有效的nk细胞培养方法，能够获得纯度较高的nk细胞。然而现在普遍使用的滋养层细胞为k562细胞，其本身就是一种肿瘤细胞，安全隐患仍然没有完全排除，因此k562细胞的应用仍然具有一定的潜在风险。
4、msc(mesenchymal stem cells，间充质干细胞)具有强大的增殖能力及多向分化潜能，可分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞等。msc来源方便，易于培养、扩增，且不存在免疫排斥，具有天然的临床应用优势。然而，现有技术中尚未有将ms
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种用于调节nk细胞数量的msc滋养层细胞及其制备方法和应用。本专利技术通过调整滋养层细胞类型，采用il-7基因修饰的msc作为滋养层细胞培养nk细胞，从而有效规避因使用k562细胞而产生的安全性问题。同时经研究发现，采用上述il-7基因修饰的msc作为滋养层细胞，还能够显著提高nk细胞增殖和活化能力。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
2、具体的，本专利技术涉及以下技术方案：
3、本专利技术的第一个方面，提供一种用于调节nk细胞数量的msc滋养层细胞，所述滋养层细胞具体为过表达il-7因子的msc细胞。
4、其中，所述msc细胞具体可以为脐带间充质干细胞(ucmsc)。
5、本专利技术的第二个方面，提供上述滋养层细胞的制备方法，所述制备方法包括：将il-7转染至msc细胞中，筛选过表达il-7的msc细胞作为滋养层细胞。
6、具体的，所述制备方法包括：
7、s1、将il-7基因片段与载体连接后导入感受态细胞中，筛选阳性克隆并进行测序验证，使用测序正确的阳性克隆提取含il-7的载体；
8、s2、将含il-7的载体与包装质粒进行慢病毒包装，获得il-7慢病毒液；
9、s3、使用上述il-7慢病毒液侵染msc细胞筛选获得过表达il-7的细胞。
10、其中，所述msc细胞具体可以为脐带间充质干细胞(ucmsc)。
11、显然，为进一步获得足够数量的滋养层细胞，可以对获得的滋养层细胞采用细胞培养基进行培养，所述细胞培养基并不做具体限定，在本专利技术的一个具体实施方式中，选用10％胎牛血清的1640培养基对滋养层细胞进行培养。
12、本专利技术的第三个方面，提供上述滋养层细胞在培养nk细胞中的应用。本专利技术通过研究证实，采用上述il-7-msc细胞作为滋养层细胞培养nk细胞，能够显著提高nk细胞的增殖能力和活化能力。
13、本专利技术的第四个方面，提供一种nk细胞的培养方法，所述培养方法包括：将上述滋养层细胞与nk细胞进行共培养，得到增殖及活化能力大幅提升的nk细胞。
14、以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
15、上述技术方案提供一种可以显著提高nk细胞增殖及活化能力的滋养层细胞的制备方法。通过基因工程技术将il-7基因组片段整合到msc细胞基因组中，经elisa检测方法验证，滋养层细胞可稳定将il-7分泌到细胞培养上清中。经本滋养层细胞刺激过的nk细胞其增殖及活化能力有了明显提升。
16、上述技术方案中将il-7基因整合到msc细胞基因组中，跟现有滋养层细胞制备方法相比，上述技术方案中滋养层细胞的应用更加安全，因此具有良好的实际应用之价值。
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1.一种用于调节NK细胞数量的MSC滋养层细胞，其特征在于，所述滋养层细胞具体为过表达IL-7因子的MSC细胞；所述MSC细胞具体为脐带间充质干细胞；
2.权利要求1所述的MSC滋养层细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述载体为质粒；优选的，所述质粒为PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP空载体质粒。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述IL-7基因片段与载体连接的具体方法包括将空载体质粒与IL-7基因片段进行酶切，将酶切后的载体质粒片段和IL-7基因片段进行连接；优选的，所述酶切采用双酶切方式进行，进一步优选的，采用限制性内切酶XbaI和EcoRI对载体和质粒进行双酶切。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，筛选方法具体为选用流式分选仪筛选具有绿色荧光标记的细胞。
6.权利要求1所述滋养层细胞在培养NK细胞中的应用；
7.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：将权利要求1所述
...【技术特征摘要】
1.一种用于调节nk细胞数量的msc滋养层细胞，其特征在于，所述滋养层细胞具体为过表达il-7因子的msc细胞；所述msc细胞具体为脐带间充质干细胞；
2.权利要求1所述的msc滋养层细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述载体为质粒；优选的，所述质粒为pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp空载体质粒。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述il-7基因片段与载体连接的具体方法包括将空载体质粒与il-7基因片段进行酶切，将酶切后的载体质粒片段和il-7基因片段进...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱学良，张文丽，闫军燕，杨学文，孙玉桃，苏彦鑫，
申请(专利权)人：山东丽山细胞医学发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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