检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种用于检测猪塞尼卡病毒A抗体的试剂盒。本发明专利技术的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒至少有包被有塞尼卡病毒A兔抗血清的酶标板和塞尼卡病毒A豚鼠抗血清。本发明专利技术具有敏感性高、特异性好、且操作简单、结果稳定、适合于批量检测，可评估未免疫猪群中塞尼卡病毒A的感染情况，及疫苗免疫后猪群的特异性抗体水平的优点。

【技术实现步骤摘要】
检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒
本专利技术涉及一种病毒抗体检测试剂，特别是一种用于检测猪塞尼卡病毒A抗体的试剂盒及非疾病检测猪塞尼卡病毒A抗体的方法。
技术介绍
塞尼卡病毒A(SenecavirusA，SVA)是微RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员。SVA基因组为单股正链RNA、不分节段、有感染性，无囊膜，全长约为7.3kb，含有5'和3'非翻译区(UTR)，以及一个长的开放阅读框(ORF)。5'UTR包含内部核糖体进入位点(IRES)(其结构和功能与猪瘟病毒的相似，IV型)，3'带有poly(a)尾巴，ORF编码的多聚蛋白由前导区(L)和3个主要蛋白区(P1、P2和P3)组成，裂解产生12个成熟蛋白(5‘-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’)。它与心病毒较为相近。纯化SVA病毒粒子的透射电子显微镜图等参见附图1。成熟的SVA病毒粒子直径大约27nm，无囊膜，呈二十面体的球状颗粒(透射电子显微镜图1(a))。病毒衣壳由60个VP1、VP2、VP3和VP4分子四种结构蛋白组成，其中VP1、VP2和VP3“拼接”在一起形成外壳(图1(b)),VP4位于衣壳内侧下方(图1(c))。病毒RNA基因组(与Vpg蛋白共价连接)包裹在病毒颗粒内(图1(c))。图1中，结构蛋白由P1区编码，包括VP1(红色)、VP2(黄色)、VP3(绿色)和VP4(蓝色)形成病毒衣壳(图1(b～d))。P2区编码的非结构蛋白包括2A、2B和2C，P3区编码的NSP包括3A、3B、3C和3D，非结构蛋白是SVA病毒在感染和复制过程中表达，它们干扰宿主细胞正常的复制周期，会劫持宿主的细胞机制来制造病毒增殖所需的蛋白质，对病毒复制增殖发挥作用(比如2A执行核糖体跳跃的功能，2C蛋白具有解旋酶活性，3B在RNA合成中起蛋白质引物的作用，3C是一种蛋白酶，负责切割SVA多聚蛋白前体和某些宿主蛋白，2C和3C还可以诱导细胞凋亡，3D是RNA依赖性RNA聚合酶，在病毒复制和VPg尿苷酰化中起作用)，但最终不作为病毒结构一部分，所以纯化的病毒颗粒中不含非结构蛋白成分，只含有结构蛋白和病毒RNA基因组(或可含有极其微量的3D聚合酶，参与将病毒RNA引入细胞核)。SVA较早出现在与美国(1988，2012)、加拿大(2007)等国，与猪原发性水泡病有关。随后扩散到巴西(2015)、中国(2015)、泰国(2017)、哥伦比亚(2017)，该病毒引起的疾病虽不及口蹄疫那样剧烈，但也颇有星火燎原之势。2015年，我国广东省的两个万头猪场首次发现该病，之后疫情蔓延至湖北(2016)、黑龙江(2017)、河南(2017)、福建(2018)、广东(2018)等地。目前，全国超过一半的省份都发现该病毒的存在，并且有些是无症状感染(Liuetal.,2020)。已经建立了多种方法来诊断SVA感染。一类是检测病毒RNA(核酸)的，其特点是特异性和灵敏度高，包括普通反转录聚合酶链式反应RT-PCR、定量RT-PCR(qRT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR、逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP)等。这属于病原学检测，但比经典的病毒分离(使用敏感细胞系或敏感动物)要快速、方便。一般动物感染病毒后2～10天左右(2～5天最佳)可用该方法检测。另一类血清学方法，主要是检测血清中的特异性抗体，国外已经开发了出竞争性ELISA和免疫荧光抗体试验进行检测，但前者需要使用专门的单克隆抗体(Gooliaetal.,2017；别的国家还没有)，后者操作繁琐需要进行细胞培养(需要的样品量大，且不适合大量样品)。细胞中和试验也可以检测血清中的SVA特异性抗体，但需要培养细胞和动用病毒，操作非常繁琐，需要的时间长，并且不适合大量样品的检测。一般动物感染病毒或注射疫苗7天至数月，可以检测到特异性抗体。SVA病毒致病的临床特征与口蹄疫、猪水泡病(此二者均为国家一类传染病)等劣性传染病的极为相似，也是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性病变，因此必须进行实验室检测予以甄别。目前，国内尚无商品化的塞尼卡病毒A抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供一种可检测猪塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，以及一种用于非疾病检测为目的的检测猪塞尼卡病毒A抗体的方法。本专利技术的检测塞尼卡病毒A的试剂盒至少有包被有塞尼卡病毒A兔抗血清的酶标板和塞尼卡病毒A豚鼠抗血清。优选地，本专利技术的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒还有终止液与显色液，或者还可以有猪塞尼卡病毒A阳性血清和阴性血清。本专利技术的非疾病检测为目的的检测塞尼卡病毒A抗体的方法为：将稀释的待检血清分别加入权利要求1至3所述的任一试剂盒的酶标板，洗板后加入用阻断稀释液稀释塞尼卡病毒A豚鼠抗血清稀释至工作浓度，封板，37℃温育1小时经再洗板拍干处理后用1×PBST稀释的兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度，封板，37℃温育1小时后再经洗板、拍干处理，再加入底物溶液，37℃温育15分钟，再加入终止液终止反应，根据490nm波长下读取光吸收值确定被检血清是否有塞尼卡病毒A抗体。本专利技术是一种的阻断ELISA方法，具体是用塞尼卡病毒A兔血清包被ELISA板，作为捕获抗体。对检测血清进行2倍系列稀释(1：4，1：8，1：16，1：32等)，之后加入定量的塞尼卡病毒A灭活的抗原。混合均匀，若检测血清中有塞尼卡病毒A特异性抗体，就会与特异性的抗原反应，从而阻断抗原与之后依次加入的塞尼卡病毒A豚鼠血清、辣根过氧物酶标记的抗豚鼠IgG结合物(即酶标抗体)，不会形成捕获抗体-抗原-第二抗体-酶标抗体复合物的链条，再加底物溶液显色、加酸终止。颜色的深浅和检测血清中的塞尼卡病毒A特异性抗体浓度呈负相关(即抗体水平越高，颜色越浅)。用酶标仪在490nm波长下测定吸光度(OD值)。以抗原OD值的一半作为临界值进行判定。本专利技术敏感性高、特异性好、且操作简单、结果稳定、适合于批量检测，可评估未免疫猪群中塞尼卡病毒A的感染情况，及疫苗免疫后猪群的特异性抗体水平。附图说明图1SVA病毒粒子结构示意图，其中：(a)，SVA病毒粒子扫描电镜照片，(b)整体前视图，(c)剖面视图，(d)SVA基因组编码产物示意图。(引自Liuetal.,2020.doi:10.3389/fvets.2020.567792)具体实施方式本专利技术以下结合实施例进行解说。一、试剂盒的制备①塞尼卡病毒A繁殖和灭活：使用IBRS-2细胞(猪肾细胞系)进行塞尼卡病毒A的繁殖，在DMEM培养基中添加10％FBS和1％双抗(青霉素、链霉素)，置5％CO2培养箱37℃培养，当IBRS-2细胞密度达80％时，接种塞尼卡病毒A(100μL/瓶)(分离自发病猪的水平皮，本研究团队保存，登录号KY747510)，约12h后CPE达90％，收获病毒(-30℃保存)。等收获的病毒量较多时(约4000mL)，加入二乙烯亚胺(BEI)灭活(终浓度1.5％，30℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，其特征在于试剂盒内至少有包被有塞尼卡病毒A兔抗血清的酶标板和塞尼卡病毒A豚抗鼠血清。/n

【技术特征摘要】
1.检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，其特征在于试剂盒内至少有包被有塞尼卡病毒A兔抗血清的酶标板和塞尼卡病毒A豚抗鼠血清。


2.根据权利要求1所述的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有终止液与显色液。


3.根据权利要求1或2所述的检测塞尼卡病毒A抗体的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有猪塞尼卡病毒A抗体阳性血清和阴性血清。


4.一种非疾病检测为目的的检测猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯霞，马军武，郭慧琛，孙世琪，张韵，白满元，郭丽莹，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62