一种检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测CAR‑T细胞scFv亲和力的方法，将CAR‑T细胞与靶抗原

【技术实现步骤摘要】
一种检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法
本专利技术涉及细胞治疗
，尤其涉及一种检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法。
技术介绍
目前，检测目标蛋白（例如CAR-T细胞scFv）对相应靶抗原亲和力的方法主要有SPR（surfaceplasmonresonance，表面等离子体共振）技术，主要操作过程为：首先将待测抗体所识别的抗原偶联在传感芯片表面，然后注入待测抗体，通过芯片表面直接监测抗体-抗原结合过程，利用分析软件提供反应动力学常数及亲和力等数据。现有专利（申请公布号：CN111351936A）公开了一种CD19-CAR亲和力检测方法，具体为：首先构建一种高表达CD19的稳定细胞株，然后检测不同浓度的CD19抗体（该抗体来源于CD19CAR-T中scFv序列）分别与CD19阳性细胞的亲和力，同时检测不同浓度的CD19蛋白与CD19CAR-T细胞的亲和力。而目前检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法脱离了CAR-T细胞而直接检测scFv蛋白对目标靶抗原的结合能力，即将scFv蛋白从CAR-T细胞分离纯化出来，然后检测scFv蛋白对目标靶抗原的亲和力，却忽略了CAR-T细胞与靶抗原细胞（例如肿瘤细胞）结合时所产生的空间位阻效应，无法真实反映CAR-T细胞对靶抗原细胞的亲和力，进而无法准确检测出CAR-T细胞对相应靶抗原+细胞的亲和力，影响后续CAR-T细胞产品研发的进度。亟需一种能够准确检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提出一种检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法，本专利技术采用流式法直接检测CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力，准确地反映了CAR-T细胞对靶抗原+细胞的识别效应。基于上述目的，本专利技术的第一个方面提供了一种检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法，将CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育，流式法检测CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力。在本专利技术的优选的实施方案中，根据流式法检测到的CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合呈现形式来判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力大小。在本专利技术的优选的实施方案中，判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力大小的方法为：(1)若流式细胞检测中呈现为CD3-靶抗原-细胞和CD3+靶抗原-细胞，则判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞具有很强的亲和力；(2)若流式细胞检测中呈现为CD3-靶抗原+细胞、CD3+靶抗原+细胞和CD3+靶抗原-细胞，则判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞具有相对较强的亲和力；(3)若流式细胞检测中呈现为CD3+靶抗原-细胞和CD3-靶抗原+细胞，则判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力较弱或无特异性亲和力。在本专利技术的优选的实施方案中，若流式法检测到的CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合呈现形式为第(1)种情况，CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力的计算如下：；其中n=CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育的时间，第0小时靶抗原+细胞的比例和第n小时靶抗原+细胞的比例均是通过流式法检测得到。在本专利技术的优选的实施方案中，若流式法检测到的CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合呈现形式为第(2)种情况，CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力的计算如下：；其中n=CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育的时间，第n小时CD3+靶抗原+细胞的比例和第0小时CD3+靶抗原+细胞的比例均是通过流式法检测得到。在本专利技术的优选的实施方案中，所述CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后，在35~38℃和3~8%CO2中共同孵育；优选地，所述CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后，在37℃和5%CO2中共同孵育；和/或，所述CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育的时间为1~5h；优选地，所述CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育的时间为1.5~2.5h。在本专利技术的优选的实施方案中，所述CAR-T细胞与靶抗原+细胞的混合比例为1:1~5:1。在本专利技术的优选的实施方案中，所述靶抗原为PSMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD138、EGFRvIII、ErbB、FAP、GD2、HER2、κ-IgLC或BCMA。基于相同的专利技术构思，本专利技术的第二个方面提供了一种筛选CAR-T细胞scFv的方法，采用上述方法获得CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力，根据获得的亲和力，筛选对靶抗原+细胞具有强亲和力的CAR-T细胞scFv。基于相同的专利技术构思，本专利技术的第三个方面提供了一种检测蛋白亲和力的方法，将待测蛋白表达于细胞中，然后将表达待测蛋白的细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育，流式法检测待测蛋白与靶抗原+细胞的亲和力。附图说明图1为CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合模式图；图2为流式法检测Daudi细胞和患者肿瘤细胞的靶抗原CD19，其中左图为流式法检测Daudi细胞的靶抗原CD19，右图为流式法检测患者肿瘤细胞的靶抗原CD19；图3为流式法检测T细胞和CD19CAR-T细胞scFv与Daudi细胞的亲和力；图4为T细胞和CD19CAR-T细胞scFv与Daudi细胞的亲和力检测结果和杀伤效果的比较；图5为流式法检测T细胞和CD19CAR-T细胞scFv与患者CD19+肿瘤细胞的亲和力；图6为T细胞和CD19CAR-T细胞scFv与患者CD19+肿瘤细胞的亲和力检测结果的比较；图7为流式法检测Daudi细胞和患者肿瘤细胞的靶抗原CD22，其中左图为流式法检测Daudi细胞的靶抗原CD22，右图为流式法检测患者肿瘤细胞的靶抗原CD22；图8为流式法检测T细胞和CD22CAR-T细胞scFv与Daudi细胞的亲和力；图9为T细胞和CD22CAR-T细胞scFv与Daudi细胞的亲和力检测结果和杀伤效果的比较；图10为流式法检测T细胞和CD22CAR-T细胞与患者CD22+肿瘤细胞的亲和力；图11为T细胞和CD22CAR-T细胞scFv与患者CD22+肿瘤细胞的亲和力检测结果和杀伤效果的比较；图12为流式法检测NCIH929细胞和RPMI8226的靶抗原BCMA；图13为流式法检测T细胞和BCMACAR-T细胞scFv与RPMI8226细胞的亲和力；图14为T细胞和BCMACAR-T细胞与RPMI8226细胞的亲和力检测结果和杀伤效果的比较；图15为流式法检测T细胞和BCMACAR-T细胞scFv与NCIH929细胞的亲和力；图16为T细胞和BCMACAR-T与NCIH929细胞的亲和力检测结果和杀伤效果的比较；图17为流式法检测T细胞、01-BCMACAR-T细胞和02-BCMACAR-T细胞scFv与NCIH929细胞的亲和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法，其中，将CAR-T细胞与靶抗原

【技术特征摘要】
1.一种检测CAR-T细胞scFv亲和力的方法，其中，将CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育，流式法检测CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力；根据流式法检测到的CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合呈现形式来判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力大小；
判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力大小的方法为：
(1)若流式细胞检测中呈现为CD3-靶抗原-细胞和CD3+靶抗原-细胞，则判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞具有很强的亲和力；
(2)若流式细胞检测中呈现为CD3-靶抗原+细胞、CD3+靶抗原+细胞和CD3+靶抗原-细胞，则判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞具有相对较强的亲和力；
(3)若流式细胞检测中呈现为CD3+靶抗原-细胞和CD3-靶抗原+细胞，则判断CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力较弱或无特异性亲和力；
CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合呈现上述三种不同等级，其亲和力大小为（1）＞（2）＞（3）。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，若流式法检测到的CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合呈现形式为第(1)种情况，CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力的计算如下：

；
其中n=CAR-T细胞与靶抗原+细胞混合后共同孵育的时间，第0小时靶抗原+细胞的比例和第n小时靶抗原+细胞的比例均是通过流式法检测得到。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，若流式法检测到的CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的结合呈现形式为第(2)种情况，CAR-T细胞scFv与靶抗原+细胞的亲和力的计算如...

【专利技术属性】
技术研发人员：何霆，齐菲菲，鲁薪安，刘光华，胡雪莲，许文平，
申请(专利权)人：北京艺妙神州医药科技有限公司，山东金赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11