一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe

【技术实现步骤摘要】
一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒。
技术介绍
食源性致病菌作为食品中生物性污染物对人类健康构成重大威胁。常见的食源性致病菌为单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes），大肠杆菌O157：H7（Escherichiacoil），金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），肠炎沙门氏菌（Salmonella）等，它们是引起人们住院最常见的原因，程度较为严重的可引起死亡。金黄色葡萄球菌简称金葡菌，隶属葡萄球菌属，是一种十分常见的食源性致病菌。金葡菌抵抗不良生存环境的能力很强，广泛存在于自然界，如水、空气、尘埃、人和动物的排泄物中，极易导致食品的污染，引发多种疾病，如肺炎、假膜性结肠炎、心包炎甚至败血症等。金葡菌在特定条件下产生的肠毒素是引导食物中毒主要致病因子之一。肠毒素对肠道破坏极大，可以引发恶心、反复呕吐、腹痛、腹泻、休克等急性中毒症状，严重可导致循环衰竭。由于金黄色葡萄球菌的生长不需要十分丰富的营养，抵抗不良环境能力和耐盐性较强，可以对各种食品构成污染。目前，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中占较大比例。我国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒病例约占食物中毒病例总数的20%~25%，美国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒数量占细菌性食物中毒总量的33%，加拿大占到45%。目前，食源性致病菌的检测方法主要有传统分离培养法、分子生物学检测方法、免疫学方法、生物传感技术等，虽然这些方法能实现对食源性致病菌的检测，但仍存在各自的缺点。金黄色葡萄球菌指标是GB4789系列食品微生物检验中最基本、最常见的检测项目。传统的培养法对金葡菌的测量方法费时费力，需要大量人工操作。如国标GB4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》，该方法需要预增菌、增菌、培养、生化鉴定等一系列步骤，花费时间在60小时以上，还需要BPW、TTB、SC增菌液，XLD，BS，HE，显色培养基，后续生化鉴定也需要大量的试剂。培养法费时费力。PCR技术操作复杂、成本高以及需要操作技术较高的工作人员；酶联免疫法价格昂贵，并且其活性容易受到温度、pH等环境因素的影响。因此，迫切需要开发一种操作简单、易于实施、快速和灵敏度高的检测方法。食品样品基质复杂，待检目标细菌少，需要新型的前处理技术和方法。Fe3O4磁性纳米粒子具有良好的生物相容性、导电性、磁性、无毒且易于合成。利用Fe3O4磁性纳米粒子偶联抗体、核酸、适配体可广泛应用于免疫学检测、细胞分离、蛋白质纯化等领域。在食源性致病菌的检测方面，Fe3O4磁性纳米粒子有效结合抗原-抗体反应的特异性和磁珠的磁场响应性，可实现从复杂基质中对目标菌的快速分离和富集提高检测效率，是有效的样品前处理方法，具有较好的开发应用前景。万古霉素作为一种广谱糖肽类抗生素，可以与革兰氏阳性菌细胞壁上的肽聚糖相结合，基于此实现与革兰氏阳性菌结合，从而达到检测的目的。2017年，孟祥玉通过合成万古霉素功能化磁珠，通过流式细胞技术在120min内实现了金黄色葡萄球菌的特异性检测，检测限为3.3CFU/mL（MengX,YangG,LiF,WeiH,XuH:SensitivedetectionofStaphylococcusaureuswithvancomycin-conjugatedmagneticbeadsasenrichmentcarrierscombinedwithflowcytometry.ACSappliedmaterialandinterfaces2017;9(25):21464-21472）。胶体金具有良好的生物相容性、大比表面积、光电特性、表面等离子共振性质，被广泛应用于生物传感领域。当金纳米粒子尺寸大于3.5nm时，其具有较大的摩尔吸光系数，且随着粒径的增加摩尔吸光系数逐渐降低，紫外可见吸收峰蓝移，呈现肉眼可见的颜色变化而被广泛用于比色传感检测中。综上所述，为了实现金黄色葡萄球菌现场筛检，开发一种快速，灵敏度高，特异性强的检测方法和试剂盒，对食品微生物检验等领域具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种金黄色葡萄球菌快速检测方法及试剂盒。一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁,洗液；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是金黄色葡萄球菌适配体修饰的四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针；所述的金黄色葡萄球菌适配体基因序列为5’NH2-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针浓度为0.1-0.5mg/mL；所述的万古霉素溶液浓度为7.8125μM-500μM；所述的胶体金粒径为13-48nm；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是由以下方法制备的：1）将六水合氯化铁和柠檬酸三钠加入到乙二醇溶液中，完全溶解后，使六水合氯化铁终浓度为0.2mol/L，柠檬酸三钠终浓度为0.034mol/L；2）向1）加入乙酸钠，乙酸钠终浓度为0.73mol/L，搅拌30min；3）将上述溶液2）转移反应釜中200℃反应10h，冷却后，取出黑色溶液，用磁铁吸出黑色固体四氧化三铁，依次用蒸馏水、乙醇交替洗涤3-5次，得到羧基化Fe3O4磁珠；4）取羧基化Fe3O4磁珠，溶于pH6的PBS缓冲液，使其浓度达到1-4mg/mL；5）向4）中加入固体1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），使其在4）的缓冲溶液浓度均达到2.5-6mg/mL,37℃孵育60min，PBS洗涤3次，重悬于pH7.4的PBS缓冲液，加入浓度为6µM-10µM金黄色葡萄球菌适配体10μL-60μL；6）混合溶液在4℃孵育过夜，用磁铁分离溶液，弃去上清，再用pH7.4PBS缓冲液洗涤3次，重悬于7.4PBS缓冲液中，得到Fe3O4磁珠特异性富集生物探针；所述的EDC和NHS最适浓度为5mg/mL；所述的金黄色葡萄球菌适配体最适浓度为10µM，最适体积为60μL；所述的胶体金溶液是由以下方法制备的：将合成所需玻璃器皿用硝酸和盐酸体积比为1:3的混合液浸泡30min，用超纯水冲洗三遍，氮气吹干，将1mM的氯金酸加热至沸腾，在搅拌的状态下快速加入4mmol/L柠檬酸三钠，20min后，得胶体金溶液。一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁，用1%甲醛灭活的109菌液阳性标准品、阴性质控去离子水；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针最适浓度为0.3mg/mL；所述的万古霉素溶液最适浓度为62.5μM；所述的胶体金最适粒径为13nm；一种金黄色葡萄球菌快本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：Fe3O4磁珠特异性富集生物探针、万古霉素溶液、胶体金溶液，磁铁；所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是金黄色葡萄球菌适配体修饰的四氧化三铁磁珠特异性富集生物探针。


2.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的金黄色葡萄球菌适配体基因序列为SEQIDNO.1。


3.根据权利要求2所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针浓度为0.1-0.5mg/mL；所述的万古霉素溶液浓度为7.8125μM-500μM；所述的胶体金粒径为13-48nm。


4.根据权利要求3所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的Fe3O4磁珠特异性富集生物探针是由以下方法制备的：
1）将六水合氯化铁和柠檬酸三钠加入到乙二醇中，完全溶解后，使六水合氯化铁终浓度为0.2mol/L，柠檬酸三钠终浓度为0.034mol/L；
2）向1）加入乙酸钠，乙酸钠终浓度为0.73mol/L，搅拌30min；
3）将上述溶液2）转移反应釜中200℃反应10h，冷却后，取出黑色溶液，用磁铁吸出黑色固体四氧化三铁，依次用蒸馏水、乙醇交替洗涤3-5次，得到羧基化Fe3O4磁珠；
4）取羧基化Fe3O4磁珠，溶于pH6的PBS缓冲液，使其浓度达到1-4mg/mL；
5）向4）中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐和N-羟基琥珀酰亚胺，使其在4）的缓冲液中的浓度均达到2.5-6mg/mL，7℃孵育60min，PBS洗涤3次，重悬于pH7.4的PBS缓冲液，加入浓度为6µM-10µM金黄色葡萄球菌适配体10μL-60μL；
6）混合溶液在4℃孵育过夜，用磁铁分离溶液，弃去上清，再用pH7.4PBS缓冲液洗涤3次，重悬于7.4PBS缓冲液中，得到Fe3O4磁珠特...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐燕飞，孙瑞蒙，邹杭锦，张扬，张新明，盛蓉田，吕瑞娟，陈丽霞，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22