美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA检测试剂盒及应用。包括浓度大于1.0×10

【技术实现步骤摘要】
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA检测试剂盒及应用
本专利技术涉及微生物检测
，尤其涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种ELISA检测试剂盒及应用。
技术介绍
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD)是弧菌科发光杆菌属细菌美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)的一个亚种，广泛分布于全球海洋环境中。该菌对鱼类、软体动物、甲壳类、爬行类、哺乳类等海洋动物都有较强的致病性，没有明显的宿主特异性。在我国，多种经济海水养殖鱼类，如许氏平鲉(Sebastesschlegeli)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)和大黄鱼(Larimichthyscrocea)等都有因感染美人鱼发光杆菌美人鱼亚种发病而造成严重经济损失的案例报道。此外，该菌还能通过伤口接触海水或食用海鲜等途径感染人，导致人严重的坏死性筋膜炎、伤口感染、败血症等症状，甚至能在短时间内导致人死亡，是少有的来自海洋环境的人鱼共患菌。目前，有关美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的流行病学、病原学、致病机理等方面已有大量研究，但是对该菌诊断和治疗方法的研究还相对较少。现阶段，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种主要依赖于传统的细菌分离纯化和基因序列比对等分子生物学方法进行鉴定，缺乏快速有效的针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测方法。ELISA检测是基于蛋白特异性结合原理，具有敏感度高、特异性好、易于操作和标准化等优点。根据现有报道，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种已经广泛分布于我国四大海区沿海水域环境中，对海水养殖产业的健康发展构成了新的威胁。因此，开发针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测方法及试剂盒，有助于在养殖生产中快速鉴别美人鱼发光杆菌美人鱼亚种，精准防控该菌的传播流行，保障渔业生产安全，为产业的健康发展提供有力的技术支撑。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是现阶段美人鱼发光杆菌美人鱼亚种主要依赖于传统的细菌分离纯化和基因序列比对等分子生物学方法进行鉴定，缺乏快速有效的针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种针对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒及其应用，通过制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活疫苗，免疫SPF鸡，以获得抗美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度和间接ELISA结果判定标准，分析间接ELISA方法的敏感性、特异性和重复性，实现快速简便、特异性好、敏感度高的检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种，从而为养殖生产中有效防控美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的感染提供保障技术。为达到上述目的，本专利技术公开了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒，包括以浓度大于1.0×109cfu/ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液作为抗原制备的鸡血清抗体样本，以保证抗原的充足，并获得最佳的免疫效果；以及包被缓冲液、洗涤缓冲液、5％脱脂奶粉液、BSA稀释液、辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡抗体、山羊源抗体专用稀释液、四甲基联苯胺底物显色液、终止液。进一步的，所述抗原为用甲醛溶液制备浓度大于1.0×109cfu/ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液。使用甲醛可以在有效灭活菌体的同时，能够保证菌体抗原蛋白的完整度。进一步的，所述抗原的制备步骤如下：(1-1)活化菌体：将保存的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌种接种于TSB琼脂平板培养基上；(1-2)制备种子液：挑取单菌落接种于少量TSB液体培养基中振荡培养；(1-3)扩大培养：取少量种子液接种于TSB液体培养基中振荡培养；(1-4)灭活：离心后获取菌体沉淀，加入含有0.5％甲醛的PBS溶液重悬至原来的体积；(1-5)灭活检验：取灭活后的菌液涂布于TSB琼脂平板培养基上检验是否灭活合格。进一步的，所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡抗血清样本的制备步骤如下：(2-1)将灭活菌液与佐剂按3:7的体积比混合后乳化制成免疫用疫苗；(2-2)用(2-1)中制成的疫苗分4次免疫健康SPF鸡；(2-3)待第4次免疫结束后适时采集鸡血，制备血清，-20℃冰箱保存备用。上述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒在间接ELISA方法检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种中的应用。利用上述试剂盒对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行间接ELISA检测，包括以下步骤：(1)将美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液在液氮和温水浴之间反复冻融，破碎菌体；(2)用包被缓冲液将灭活菌液稀释至l07CFU/mL，横向包被酶标板，100μL/孔，37℃包被2h；(3)倾去孔中液体，在吸水纸上拍干，加入100μL洗涤液冲洗酶标板，在吸水纸上拍干，如此反复洗涤3次；(4)加入5％脱脂奶粉液，300μL/孔，37℃封闭2h，洗涤3次；(5)加入100μLBSA稀释液稀释的抗血清，37℃温育1h，每次都需加稀释液的对照组血清设立阴性对照和不加一抗的空白对照，洗涤3次；最后一次停留5min；(6)用山羊源抗体专用稀释液将酶标二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡抗体)稀释8000倍，100μL/孔，37℃温育1h，洗涤3次；(7)加入100μL底物四甲基联苯胺底物显色液，室温避光显色10min；(8)每孔加入100uL终止液终止反应，用酶标仪测取OD450。本专利技术的有益效果在于：(1)对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的特异性强，灵敏度较高，检测结果通过酶标仪判读，减少主观性判断。(2)操作简便易行，检测成本低廉，适宜推广。(3)不需要无菌操作，可应用于现场检测，并进行大批量检测。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒，包括浓度大于1.0×109cfu/ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液作为抗原，以及美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡抗血清样本。另外，还包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、5％脱脂奶粉液、BSA稀释液、辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡抗体、山羊源抗体专用稀释液、四甲基联苯胺底物显色液、终止液。其中，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液的制备包括以下步骤：(1)取-80℃冰箱保存的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株接种于TSB琼脂平板培养基上，28℃条件下倒置培养24h。(2)挑取单菌落接种于20mLTSB培养基中，28℃、180r/min振荡培养8～10h，制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的种子液。(3)取上述2mL的种子液接种于200mLTSB培养基中，28℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒，其特征在于：包括以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液抗原制备的鸡血清抗体样本。/n

【技术特征摘要】
1.美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的ELISA检测试剂盒，其特征在于：包括以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液抗原制备的鸡血清抗体样本。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、5％脱脂奶粉液、BSA稀释液、辣根过氧化物酶标记山羊抗鸡抗体、山羊源抗体专用稀释液、四甲基联苯胺底物显色液、终止液。


3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原为用甲醛溶液制备浓度大于1.0×109cfu/ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活菌液。


4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原的制备步骤如下：
(1-1)活化菌体：将保存的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌种接种于TSB琼脂平板培养基上；
(1-2)制备种子液：挑取单菌落接种于少量TSB液体培养基中振荡培养；
(1-3)扩大培养：取少量种子液接种于TSB液体培养基中振荡培养；
(1-4)灭活：离心后获取菌体沉淀，加入含有0.5％甲醛的PBS溶液重悬至原来的体积；
(1-5)灭活检验：取灭活后的菌液涂布于TSB琼脂平板培养基上检验是否灭活合格。


5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鸡抗血清样本的制备步骤如下：
(2-1)将灭活菌液与佐剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正，于永翔，王丽芳，王印庚，罗展，王学波，李永杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37