一种透明质酸检测试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种检测透明质酸的试剂盒及其方法。本发明专利技术通过将HABP包被于胶乳微球上，并利用封闭剂对试剂盒进行封闭后，在一定波长下，用来检测血清中透明质酸的含量。实验结果表明，本发明专利技术所述的胶乳免疫比浊法制备的透明质酸检测试剂盒相对其他方法学的透明质酸检测试剂盒在准确度、精密度、线性、稳定性、灵敏度方面均较好，且该方法较其他方法安全性好，检测速速快，且易自动化，试用在产业上有效地推广应用。地推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸检测试剂盒及其方法


[0001]本专利技术涉及体外诊断试剂生化试剂
，具体涉及一种透明质酸检测试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]透明质酸(hyaluronic acid HA)是一种大分子的多糖，其主要合成场所是间质细胞，并通过淋巴循环进入人体血液中，后在肝脏中代谢，通过肾小球滤过后排出。一般正常人血清含HA的量小于100ng/ml。由于透明质酸是经过肝内皮细胞摄取降解，所以患有肝病的患者尤其是肝硬化的患者，由于肝内皮细胞受损，导致其对透明质酸的摄取和降解功能的下降，使得肝病患者血清中的透明质酸含量增加，所有通过检测血清中透明质酸的含量的变化可以做为早期诊断肝纤维化的指标。另外，患有类风湿性关节炎和硬皮病时，会增加血清中透明质酸的来源，而使其含量增加；或者肝肾疾病会影响人体内透明质酸的排出，而使其在血清中的含量增加。所以，通过检测血清中透明质酸含量的变化，可以反映肝脏病变及肝硬化程度。
[0003]目前血清中透明质酸的含量的检测方法主要有放射性免疫检测法、酶联免疫检测法 (ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)。放射性免疫检测法主要是在未知HA量的标本中加入一定量透明质酸结合蛋白(HABP)；再加入碘标记透明质酸，使其与标本反应所剩的HABP 结合；再用第一抗体即羊或者兔抗HABP血清、第二抗体即驴抗羊或羊抗兔血清，将HABP沉淀下去，测定其放射性，HABP所结合的碘标记的HA与标本中HA含量呈负相关，用HA标准品同步对比操作作出放射性浓度标准曲线，把测得的待测标本放射性相对值在标准曲线上查出对应浓度值。但该方法对设备和人员要求高，不利于应用推广。ELISA检测HA主要是以HABP (透明质酸结合蛋白)为抗体、双夹心法为基础，与放免法比较，灵敏度相近，但检测血清 HA值却明显低于放免法。化学发光免疫分析法检测血清中的透明质酸，主要基于竞争和夹心两种技术，竞争法的原理是将样本中的HA通过与固相载体上的包被HA与稀释液中的HABP结合实现检测，样本HA浓度越高，发光值越低；夹心法检测通过形成固相包被HABP
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HA
‑
HABP”夹心复合物”实现检测，发光值与样本HA浓度成正比。但该方法与酶免和放免检测的正常人血清中HA的含量差异很大，分析可能原因是HA本身是一类分子量大小不均匀的多糖分子，其分子量的范围从105
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107，双抗体夹心法需要有20个以上的糖基与蛋白结合才能够检测出来，而放免和酶免不需要HA有20个以上的糖基，所以其检测的范围较双抗体夹心法广泛。而酶免和放免检测透明质酸均有其不足之处。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测血清样本中透明质酸含量的操作简便、成本低、可自动化、准确度高的方法，使其能够在临床上得到广泛应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种透明质酸检测试剂盒，该试剂盒包含试剂R1、R2和校准品；其中试剂R1中包含
缓冲液、氯化钠、防腐剂以及稳定剂。所述试剂R2包含活化缓冲液、包被缓冲液、封闭液、贮存缓冲液，以及胶乳微球和HABP，以及偶联剂。
[0007]本专利技术的检测原理如下：将透明质酸结合蛋白(HABP)通过偶联剂包被至胶乳微球上，样本中的HA与微球上的HABP特异性结合后，通过在一定波长下测定吸光度的变化，此种变化与样本中的HA含量成比例，从而定量测定出血清样本中HA的含量。
[0008]本专利技术所述试剂R1组分浓度为：缓冲液0.1
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100mmol/L、氯化钠1
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20g/L、防腐剂 0.1
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10g/L、稳定剂0.1
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10g/L；所述试剂R2组分浓度为：活化缓冲液0.1
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100mmol/L、包被缓冲液0.1
‑
100mmol/L、封闭液0.1
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100mmol/L、贮存缓冲液0.1
‑
100mmol/L、胶乳微球 1
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100ml/L、HABP 2
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200ml/L、偶联剂1 0.1
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5g/L，偶联剂2 0.05
‑
2.5g/L。
[0009]本专利技术所述试剂R1组分优选的浓度为：缓冲液25mmol/L、氯化钠9g/L、防腐剂5g/L、稳定剂5g/L；所述试剂R2组分优选的浓度为：活化缓冲液50mmol/L、包被缓冲液50mmol/L、封闭液25mmol/L、贮存缓冲液50mmol/L、胶乳微球30ml/L、HABP 50ml/L、偶联剂1 1g/L，偶联剂2 0.5g/L。
[0010]优选的试剂R1中，所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris
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HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种；试剂R2中，所述的活化缓冲液为磷酸缓冲液、Tris
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HCl， MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，所述的包被缓冲液为磷酸缓冲液、Tris
‑
HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，所述的封闭液液为磷酸缓冲液、Tris
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HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，并在其中加入牛血清白蛋白，所述的贮存缓冲液为磷酸缓冲液、Tris
‑
HCl，MES缓冲液、HEPES 缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
[0011]优选的所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH值为5.0
‑
9.0。
[0012]为了提高该专利技术试剂盒的稳定性，优选的试剂R1和R2中的稳定剂为PEG系列。试剂R1和R2中的防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列，优选Proclin 300。试剂R2中的偶联剂为，N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(EDC)。试剂R2中的胶乳微球的粒径为0.08
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0.5μm。
[0013]本专利技术还提供了一种上述透明质酸检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)依次加入试剂R1，待测样本，混匀，37℃下温育4
‑
10分钟，后加入试剂R2，混匀，37℃温育4
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10分钟后，600nm波长下测定吸光度；(2)根据定标的标准曲线计算待测样品中透明质酸的浓度。
[0014]优选的，标准曲线采用HA校准品定标，HA校准品的浓度为0～1000ng/ml。
[0015]本专利技术所述试剂盒通过将天然蛋白HABP包被于胶乳微球上，使其能够特异性结合血清样本中的HA。本专利技术测定血清中HA含量。试验结果表明，本专利技术所述的透明质酸检测试剂盒测定结果与放射性免疫分析法的测定结果一致，较酶免和化学发光的试剂测定结果准确，且稳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含试剂R1和R2和校准品，其中试剂R1中包含缓冲液、氯化钠、防腐剂以及稳定剂；试剂R2包含活化缓冲液、包被缓冲液、封闭液、贮存缓冲液，以及胶乳微球和HABP，以及偶联剂。2.根据权利要求1所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1组分浓度为：缓冲液0.1
‑
100mmol/L、氯化钠1
‑
20g/L、防腐剂0.1
‑
10g/L、稳定剂0.1
‑
10g/L；所述试剂R2组分浓度为：活化缓冲液0.1
‑
100mmol/L、包被缓冲液0.1
‑
100mmol/L、封闭液0.1
‑
100mmol/L、贮存缓冲液0.1
‑
100mmol/L、胶乳微球1
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100ml/L、HABP2
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200ml/L、偶联剂10.1
‑
5g/L，偶联剂20.05
‑
2.5g/L。3.根据权利要求2所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1组分浓度为：缓冲液25mmol/L、氯化钠9g/L、防腐剂5g/L、稳定剂5g/L；所述试剂R2组分浓度为：活化缓冲液50mmol/L、包被缓冲液50mmol/L、封闭液25mmol/L、贮存缓冲液50mmol/L、胶乳微球30ml/L、HABP50ml/L、偶联剂11g/L，偶联剂20.5g/L。4.根据权利要求1
‑
3所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris
‑
HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种；试剂R2中，所述的活化缓冲液为磷酸缓冲液、Tris
‑
HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，所述的包被缓冲液为磷酸缓冲液、Tris

【专利技术属性】
技术研发人员：靳晓黎，孟琛，孙小芳，
申请(专利权)人：北京华宇亿康生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：