产生GH8木聚糖酶变体的方法技术

本发明专利技术涉及产生GH8木聚糖酶变体的方法，具体地涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及制备和使用所述多肽的方法。

Method for producing GH8 xylanase variants

The present invention relates to a method for producing a GH8 xylanase variant, in particular to a separated polypeptide having xylanase activity and a separate polynucleotide encoding said polypeptide. The present invention also relates to nucleic acid constructs comprising the polynucleotides, vectors and host cells, and methods of making and using said polypeptides.

【技术实现步骤摘要】
产生GH8木聚糖酶变体的方法本专利技术申请是基于申请日为2010年12月9日，申请号为201080063420.4(国际申请号为PCT/EP2010/069249)，名称为“产生GH8木聚糖酶变体的方法”的专利技术专利申请的分案申请。涉及序列表本申请包含计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式通过提述并入本文。专利
本专利技术涉及产生保留木聚糖酶活性的亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法。本专利技术还涉及具有木聚糖酶活性的分离的GH8多肽变体和编码所述多肽变体的分离的多核苷酸。本专利技术进一步涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法，如，制备生面团或从这种生面团制备的烘烤食物。更具体而言，本专利技术涉及这样的工艺，其中所述生面团与用亲本GH8木聚糖酶制备相比，粘性较低，和/或其中面包具有增加的体积。专利技术背景糖和二醇缀合物(glycol-conjugate)是糖基转移酶(GT)和糖苷水解酶(GH)的底物。糖苷水解酶的结构在二十世纪八十年代逐渐开始的得到解析。与此同时，发现了新GH蛋白，并确定了其氨基酸序列。从这些新数据，得到了两个主要的观察结果。1)用于命名酶家族的经典的E.C.命名系统不够精确至能够对越来越多的具有不同结构但实现相同酶反应的酶进行分类。2)通过同源性相关联的酶可具有不同的酶活性，因此亦使得E.C.命名系统对于这些相关的酶是易混淆的。在1991年，由BernardHenrissat基于酶结构提出了新的基于家族的命名系统(HenrissatB.,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.280:309-316(1991)；HenrissatB.,BairochA.Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.293:781-788(1993)；HenrissatB.,BairochA.Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.Biochem.J.316:695-696(1996)以及DaviesG.,HenrissatB.Structuresandmechanismsofglycosylhydrolases.Structure3:853-859(1995)。最新的分类系统可从Carbohydrate-ActiveEnZymes网站获得(CAZy)。基于氨基酸序列相似性将糖苷水解酶归类为家族的分类的导入是因为序列和折叠类似性之间有直接关系，而预期此种分类会：(i)反映酶的结构特征，这无法仅通过底物特异性反映，(ii)协助揭示酶之间的进化关系，和(iii)提供用于得到机理信息的方便工具。将氨基酸序列根据其与特定GH家族的相似性分组可给出针对新的假设蛋白的活性方面的概念。这些氨基酸序列中的一些通过同源性归类为一个GH家族，后来表明其具有某种酶活性。因此，简言之，将新氨基酸序列归类于一个GH家族并未具体表明确切的酶活性。该酶活性必需通过克隆或纯化蛋白的活性测定来阐明。若该测定是困难的，蛋白实际功能的确定可能多年仍无法揭示。糖苷水解酶家族8(GH8)包含具有几种已知活性的酶：内切葡聚糖酶(EC:3.2.1.4)；地衣聚糖酶(lichenase)(EC:3.2.1.73)；壳聚糖酶(EC:3.2.1.132)。一些木聚糖酶受见于面粉中的组分所抑制，这使得它们不适用于制造基于生面团的产物。GH8木聚糖酶不受生面团中的组分所抑制，且其在生面团中仅需要非常低剂量以提供烘烤面包的体积增加。不幸的是，在烘烤领域中众所周知，使用任何目前为止鉴定出的天然存在的GH8木聚糖酶得到粘性生面团，对其存在操作困难。
技术实现思路
专利技术人鉴定出了在广泛范围的GH8木聚糖酶中保守的特征性氨基酸基序，其包含这些木聚糖酶中活性位点中的谷氨酸(E)亲核体：[ST]E[GAS]X[GAS][YFW](SEQIDNO:1)。使用了分子建模，并鉴定出沿GH8木聚糖酶活性位点线性排列的结构环(参见图1)。该环包含保守的GH8基序N端侧直接侧翼的约20个连续氨基酸(图1)。制造了合成表达构建体(SEQIDNO:2)，其编码来自芽孢杆菌属菌种(Bacillussp.)KK-1(UNIPROT登录号O52730；SEQIDNO:4)的成熟GH8木聚糖酶。该合成构建体包含编码相互融合的成熟GH8木聚糖酶多肽编码序列和异源信号肽的序列，该构建体的核酸序列就芽孢杆菌属表达进行了优化。编码的异源信号肽和成熟的GH8木聚糖酶的氨基酸序列示于SEQIDNO:3。SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的成熟多肽的氨基酸序列不言自明是相同的。保守的GH8基序见于SEQIDNO:3或4中所示的成熟多肽的氨基酸位置65-70。SEQIDNO:3中保守GH8基序侧翼的环通过其中包含的氨基酸的定点诱变来进行突变。进行了单个氨基酸的缺失、插入和取代，及其某些组合，以产生多种具有木聚糖酶活性的GH8变体，参见下文。在烘烤应用中调查了变体的活性，且其显示令人惊讶的饶有兴趣和有希望的特性。相应地，在第一个方面，本专利技术涉及产生亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法，所述方法包括下述步骤：a)提供编码成熟亲本GH8木聚糖酶多肽的多核苷酸，所述多肽包含第一保守GH8木聚糖酶基序：[ST]E[GAS]X[GAS][YFW](SEQIDNO:1)，b)将至少一个突变导入编码多核苷酸，由此将一个改变在第一保守GH8木聚糖酶基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处导入编码的多肽，和c)将突变的多核苷酸在合适宿主细胞中并在有助于产生变体的条件下进行表达，其中所述变体具有木聚糖酶活性。在第二个方面，本专利技术涉及亲本GH8木聚糖酶多肽的分离的变体，所述多肽包含第一保守GH8木聚糖酶基序：[ST]E[GAS]X[GAS][YFW](SEQIDNO:1)，其中所述变体相对于亲本在第一保守GH8基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个中包含至少一个氨基酸改变，且其中所述变体具有木聚糖酶活性。在第三个方面，本专利技术涉及包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述核酸序列编码第二个方面的变体多肽。第四个方面涉及包含第三个方面的多核苷酸的核酸构建体。第五个方面涉及包含第四个方面的核酸构建体的重组表达载体。第六个方面涉及重组宿主细胞，其包含前述方面的重组表达载体、第四个方面的核酸构建体或可操作连接的第三个方面的多核苷酸和一个或多个调控序列，所述调控序列指导变体多肽的产生。第七个方面涉及产生第二个方面的变体多肽的方法，包括：(a)在有助于变体产生的条件下，培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码变体多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述变体。其他方面涉及包含第二个方面的变体多肽的组合物，用于制备烘烤产品的方法(所述方法包括将第二个方面的变体多肽添加至所述烘烤产品的生面团的步骤)，或包含第二个方面的变体多肽的面包改善组合物。本专利技术的另一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法，所述方法包括下述步骤：a)提供编码成熟亲本GH8木聚糖酶多肽的多核苷酸，所述多肽包含第一保守GH8木聚糖酶基序：[ST]E[GAS]X[GAS][YFW]  (SEQ ID NO:1)，b)将至少一个突变导入编码多核苷酸，由此将至少一个改变在第一保守GH8木聚糖酶基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处导入编码的多肽，和c)将突变的多核苷酸在合适宿主细胞中并在有助于产生变体的条件下进行表达，其中所述变体具有木聚糖酶活性。

【技术特征摘要】
2009.12.09 EP 09178558.41.一种产生亲本GH8木聚糖酶多肽的变体的方法，所述方法包括下述步骤：a)提供编码成熟亲本GH8木聚糖酶多肽的多核苷酸，所述多肽包含第一保守GH8木聚糖酶基序：[ST]E[GAS]X[GAS][YFW](SEQIDNO:1)，b)将至少一个突变导入编码多核苷酸，由此将至少一个改变在第一保守GH8木聚糖酶基序N端侧侧翼的20个氨基酸位置中的一个或多个处导入编码的多肽，和c)将突变的多核苷酸在合适宿主细胞中并在有助于产生变体的条件下进行表达，其中所述变体具有木聚糖酶活性。2.权利要求1的方法，其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:154和SEQIDNO:159中任一所示的GH8木聚糖酶的组中的GH8木聚糖酶的成熟部分至少60％相同。3.权利要求1或2的方法，其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶包含第二保守GH8木聚糖酶基序：[ND][AS]X[RLPQ](SEQIDNO:155)。4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述成熟亲本GH8木聚糖酶包含或组成为SEQIDNO:3的氨基酸28至433。5.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·贝尔，M·D·托斯卡诺，E·P·弗里斯，M·莫勒英格尔森，H·伦德克维斯特，S·索尔洛贝丹兹，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK