用于检测肠细胞屏障机能障碍的方法和组合物技术

公开了检测患者的肠细胞屏障机能障碍的方法。在一种方法中，将患者肠上皮细胞(IEC)、口咽上皮细胞(OEC)或者口腔上皮细胞(BEC)用对半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶-3&7特异性的可检测的探针染色，并且观察细胞是否存在半胱氨酸蛋白酶-1的水平升高，通过半胱氨酸蛋白酶-1标记剂与半胱氨酸蛋白酶-3&7明显更高比率作为证据，其作为细胞屏障机能障碍的指示剂。在第二方法中，通过探针基共聚焦激光显微内镜(pCLE)获得患者的IEC、OEC或者BEC原位图像，并且通过图像分析细胞间隙密度。还公开的是用于检测肠细胞屏障机能障碍的一种探针组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于检测与肠易激综合症(IBS)和炎症性肠病(IBD)有关的细胞屏障机能障碍的方法和组合物。专利技术背景肠易激综合症(IBS)是一种常见临床病况，特征在于肠频率、一致性的改变和腹部不适。使用RomeII标准的流行病学研究显示在北美洲IBS的流行从5％变化到12％，在亚洲从1％到22％和在欧洲从1％到8％。在大多数研究中观察到女性占优，特别是西方国家。IBS的主要驱动者之一可能是异常的肠上皮细胞(IEC)挤压。炎症性肠病(IBD)是一组大肠和小肠的发炎病况。IBD的主要类型是克罗恩疾病和溃疡性结肠炎。IBS和IBD二者可以归因于或者由于异常的肠上皮细胞(IEC)挤压而恶化，从而导致了患者的细胞屏障机能障碍。
技术实现思路
在一种实施方案中，本专利技术包括一种检测患者的肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)的方法，其在于：(a)用探针染色患者的肠、口咽或者口腔上皮细胞，该探针具有共轭到半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1抑制剂上的可检测的标记剂，和(b)相对于分别来自正常人的类似染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞，检查该染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞的可检测的标记剂的升高水平的存在，作为与患者肠、口咽或者口腔上皮细胞有关的半胱氨酸蛋白酶-1超过正常水平的证据。患者肠上皮细胞(IEC)，口咽上皮细胞(OEC)或者口腔上皮细胞(BEC)中半胱氨酸蛋白酶-1水平的升高是与患者的肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)有关的细胞屏障机能障碍的指征。在一种实施方案中，患者IEC获自来自于患者的肠内壁的活组织检查或者体腔吸出，用荧光标记剂体外染色，并且分析荧光水平。在另外一种实施方案中，患者OEC获自患者的口咽细胞的牙齿活组织检查或者体腔吸出，用荧光标记剂体外染色，并且分析荧光水平。在又一实施方案中，患者BEC是通过例如轻轻的药签擦拭面颊来获得的，用荧光标记剂体外染色，并且分析荧光水平。荧光检测可以通过荧光显微镜法，荧光板阅读器，流式细胞测量法或者适于检测和测量荧光水平的其他方法来进行。在另一种通用实施方案中，OEC或者BEC中半胱氨酸蛋白酶-1水平升高可以诊断克罗恩疾病(IBD的一种主要类型)。所述探针可以是半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂例如四肽YVAD和荧光染料的共轭物。一种示例性的探针具有结构AlexaFluor488-GGGG-YVAD-FMK。在一种示例性实施方案中，将细胞用下面的来染色：(a)第一探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂上的第一可检测的标记剂，和(b)第二探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-3&7抑制剂上的，不同于第一标记剂的第二可检测的标记剂。分析所述细胞来测定与半胱氨酸蛋白酶-1有关的标记剂相对于与半胱氨酸蛋白酶-3&7有关的标记剂的比率。健康受测试者的半胱氨酸蛋白酶-1与半胱氨酸蛋白酶-3&7标记剂之比相比于具有IBS或IBD的受测试者明显更低，例如低了至少40％。一种示例性第二探针是半胱氨酸蛋白酶-3/7抑制剂I和荧光染料的共轭物，它的峰值吸收和发射波长不同于第一探针荧光染料。当IEC中的半胱氨酸蛋白酶-1的水平明显高于正常水平时，所述方法可以用于指征通过半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂、抗炎药、益生菌剂或者这些试剂的组合的患者治疗。在另一种通用实施方案中，IEC、OEC或BEC是原位染色的，并且通过探针基共聚焦激光显微内镜(pCLE)来观察。在其他方面，本专利技术包括一种检测患者肠细胞屏障机能障碍的方法，其包括步骤：通过探针基共聚焦激光显微内镜(pCLE)获得患者的IEC的原位图像，和计算所述图像中的IEC，来确定成像的IEC中的间隙的数目。约每百细胞大于2的间隙密度是细胞屏障机能障碍的指征，并且可以用作患者通过例如益生菌剂治疗的指征。还公开的是一种用于检测肠细胞屏障机能障碍的探针组合物。该组合物包括(a)第一探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂上的第一可检测的标记剂，和(b)第二探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-3&7抑制剂上的，不同于第一标记剂的第二可检测的标记剂。该第一探针可以是四肽YVAD和荧光染料的共轭物，例如探针具有结构AlexaFluor488-GGGG-YVAD-FMK。该第二探针可以是半胱氨酸蛋白酶-3/7抑制剂I和不同于第一探针的荧光染料的共轭物。当结合附图来阅读本专利技术下面的详细说明时，本专利技术的这些和其他目标和特征将变得显而易见。附图说明图1.在极化的T84单层中，IEC诱导的细胞挤压的半胱氨酸蛋白酶-1活化。(a)在尼日利亚菌素处理的(50μM)培养的T84细胞中，活化的半胱氨酸蛋白酶-1代表性FLICA1染色(绿色)。红色，ZO-1染色；蓝色，DAPI，绿色，FLICA1染色(比例尺，50μm)。(b)在尼日利亚菌素处理的(50μM)T84细胞中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-1(p10)表达。(c)用尼日利亚菌素处理的T84细胞的TEM外观：染色质集中在核膜周围，细胞质中的致密体的小的和大的透明液泡，和增加的基质密度的完好的线粒体。A，顶部表面，B，基部表面，N，核(比例尺，2μm)。图2.在半胱氨酸蛋白酶-1活化之后，极化的单层改变的渗透性。(a)用尼日利亚菌素处理的，用Ac-YVAD-CMK反转的T84单层的TER(±S.D.)中与剂量相关的降低(在尼日利亚菌素25μM时)。(b)TER的时间相关的降低，其是通过用尼日利亚菌素处理的，用Ac-YVAD-CMK反转的T84单层的ECIS来测量的(在尼日利亚菌素25μM时)。(c)YG微球和大肠杆菌TMW2.497沿着用尼日利亚菌素10μM处理一整夜的单层的移动。红色，ZO-1染色；中心图像绿色，1μm微球，右侧图像绿色，大肠杆菌TMW2.497(比例尺，50μm)。数据表示的是三个的独立实验。*P<0.05。图3.在IL-10KO中与WT小鼠比较的增加的半胱氨酸蛋白酶-1活化。(a)通过免疫印迹分析的在IL-10KO中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-1(p10)表达。(b)IL-10KO(N＝5)的肠组织中增加的活性IL-1β。(c)来自WT和IL-10KO小鼠的PCNA染色的肠区的代表性图像(比例尺，50μm)。(d)每个啮齿动物肠组织的腺窝的阳性PCNA染色细胞的数目。*P<0.05。图4.IL-10KO小鼠中到内腔微粒和微生物的增加的渗透性。(a)口服的FITC-右旋糖苷向血液样品中的渗透(N＝4)。(b)口服的0.5μm微球在血液样品中的存在(N＝6)。(c)大肠杆菌TMW2.497向肝脏和脾脏的迁移(N＝4)。(d)进入小鼠肠的挤压区的大肠杆菌TMW2.497的代表性图像。*P<0.05，**P<0.01。图5.半胱氨酸蛋白酶-1对于体内微球的IEC挤压和渗透的调节。(a)用Ac-YVAD-CMK10mg/kg在IL-10KO小鼠中对于IEC挤压的治疗，其是通过使用共聚焦显微内镜经时测量的上皮间隙密度来测定的(N＝5)。(b)口服的0.5μm微球在IL-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测患者的肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)的方法，其包含：(a)用探针染色患者的肠、口咽或者口腔上皮细胞，该探针具有共轭到半胱氨酸蛋白酶‑1抑制剂上的可检测的标记剂，和(b)相对于分别来自正常人的类似染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞，检查该染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞的可检测的标记剂升高水平的存在，作为与患者肠、口咽或者口腔上皮细胞有关的半胱氨酸蛋白酶‑1超过正常水平的证据，(c)其中患者肠、口咽或者口腔上皮细胞中半胱氨酸蛋白酶‑1的升高水平是与患者肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)有关的细胞屏障机能障碍的指征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.09.05 US 61/697,1901.一种检测患者的肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)的方法，其
包含：
(a)用探针染色患者的肠、口咽或者口腔上皮细胞，该探针具有共轭到半
胱氨酸蛋白酶-1抑制剂上的可检测的标记剂，和
(b)相对于分别来自正常人的类似染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞，检
查该染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞的可检测的标记剂升高水平的存在，
作为与患者肠、口咽或者口腔上皮细胞有关的半胱氨酸蛋白酶-1超过正常水
平的证据，
(c)其中患者肠、口咽或者口腔上皮细胞中半胱氨酸蛋白酶-1的升高水平
是与患者肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)有关的细胞屏障机能障碍
的指征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的染色包含步骤：(i)通过活组
织检查或者体腔吸出来从患者获得患者肠上皮细胞，和(ii)体外染色该细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的染色包含步骤：(i)通过牙科
活组织检查获得患者的口咽上皮细胞，和(ii)体外染色该细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的染色包含步骤：(i)从患者的
颊拭子获得口腔上皮细胞，和(ii)体外染色该细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该可检测的标记剂是荧光，和所述
的检查是通过荧光显微镜法、荧光板阅读器或者荧光流式细胞测量法来进行
的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的染色包括将可检测的标记剂
施用到患者肠中的肠上皮细胞上，和所述的检查包括内窥镜肉眼观察该染色
的细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的染色包括将可检测的标记剂
施用到患者口咽中的口咽上皮细胞，和所述的检查包括通过患者口咽的荧光
检测来肉眼观察该染色的细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的染色包括将可检测的标记剂
施用到患者口腔中的口腔上皮细胞，和所述的检查包括通过患者口腔的荧光
检测来肉眼观察该染色的细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该探针是口腔的四肽YVAD和荧光
染料的共轭物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该探针具有结构AlexaFluor
488-GGGG-YVAD-FMK。
11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用对半胱氨酸蛋白酶-3&7
特异性的第二可检测的探针染色所述的肠、口咽或者口腔上皮细胞，和测定
与半胱氨酸蛋白酶-1有关的标记剂和与半胱氨酸蛋白酶-3&7有关的标记剂
之间的比率。
12.根据权利要求11所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰德尔·托马斯·欧文，刘捷，伊丽莎白·梅利卡·戴维斯，
申请(专利权)人：刘捷，
类型：发明
国别省市：美国;US