本发明专利技术公开一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法；先利用消化后的麦醇溶蛋白处理细胞，在洗去残留的消化后的麦醇溶蛋白后加入一定量益生菌共孵育一定时间后洗去，以确定益生菌改善被消化麦醇溶蛋白破坏的细胞紧密连接的能力。本发明专利技术的体外实验模型能反映益生菌对麦醇溶蛋白已造成的肠上皮损伤的实际修复作用，所得结果符合益生菌对肠道内已形成的肠道屏障破坏的修复能力，从而在细胞水平为确定益生菌及其他微生物是否能够增强肠道细胞紧密连接提供了一个更为便捷准确的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及益生菌筛选
，尤其是涉及一种在体外快速判断益生菌是否能增强肠道细胞紧密连接的方法。
技术介绍
随着现代生活节奏的加快，越来越多的中国人也患有了过去在西方国家比较流行的炎症性肠病(IBD)，这种疾病包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。已有报道，肠道屏障的完整性是人类健康的保证，肠道细胞紧密连接(TJ)的破坏是引发炎症性肠病的重要因素，因此增强肠道细胞紧密连接也成为了保护人类抵御炎症性肠病的有效途径。对于炎症性肠病的确切发病机理现仍不清晰，而传统的抗生素药物、免疫调节制剂等有较强的副作用，因此益生菌被更多的研究者提出用以作为一种长效无害的预防及治疗方式。目前，已在肉鸡和仔猪等动物实验研究中发现，当摄入足够多数量益生菌的时候，由于一些菌株能够直接影响紧密连接蛋白的表达而对肠道屏障起到保护作用，因此被广泛应用于饲料生产中。然而，动物模型实验周期长、费用高，不适合大规模筛选使用，且随着动物伦理要求的日益严格，未来使用实验动物将会更加困难。因此发展一种可有效反映益生菌对紧密连接调节作用的体外研究方法，能够在短时间内快速判断其增强肠道细胞紧密连接的能力，有助于快速开发具有调节肠道健康的益生菌产品。运用本专利技术大规模快速筛选并结合动物实验验证后开发的益生菌及其相关食品工业产品，有利于帮助人类预防或者干预炎症性肠病等相关肠道紊乱疾病。至今为止，所有使用消化后的麦醇溶蛋白进行益生菌缓解炎症性肠病的体外模拟实验中，采用的都是益生菌与消化后的麦醇溶蛋白同时加入细胞培养液再与细胞共同培养，由于有研究表明一些从发酵食品分离出的益生菌能够降解麦醇溶蛋白，因此这类常规的方法反映的结果与益生菌在肠道内缓解炎症性肠病的实际情况并不吻合，用此类方法得到益生菌对肠道细胞紧密连接的作用并不一定是益生菌本身对肠道紧密连接的增强作用，而可能是由于益生菌降解消化后的麦醇溶蛋白从而减少了麦醇溶蛋白对细胞紧密连接的破坏。因此利用消化麦醇溶蛋白、益生菌及动物细胞共孵育的方法体外模拟益生菌对炎症性肠病的缓解作用已不能准确的反映益生菌在体内调节肠道屏障的功能，需要建立一种弥补传统方法缺陷的新方法，以满足在体外快速准确地筛选到具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的需求。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术公开一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法。本专利技术先利用消化后的麦醇溶蛋白处理细胞，在洗去残留的消化后的麦醇溶蛋白后加入一定量益生菌共孵育一定时间后洗去，以确定益生菌改善被消化麦醇溶蛋白破坏的细胞紧密连接的能力。本专利技术的技术方案如下：一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法，包括下列步骤：(1)用RoswellParkMemorialInstitute1640Glutamaxmedium(RPMI1640)培养基对在体外可进行培养的人或动物肠道细胞进行培养至单层细胞；所述肠道细胞包括且不限于人结肠癌细胞HT-29、人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84；(2)模拟消化道环境用胃蛋白酶结合胰蛋白酶消化处理麦醇溶蛋白即gliadin，灭活后真空冷冻干燥得到消化后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin；(3)益生菌培养；(4)用PT-gliadin及益生菌菌悬液先后分段对步骤(1)所得的单层肠道细胞进行孵育；(5)细胞紧密连接指标检测。步骤(2)的详细操作方法为：称取60mg的麦醇溶蛋白溶解于10mLpH＝4.0的50mM醋酸钠缓冲液，向溶液中加入3mg的胃蛋白酶后，置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，再向溶液中加入71mg无水磷酸氢二钠，并用氢氧化钠快速调节pH至7.0，之后加入3mg胰蛋白酶，并将混合溶液置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，所得反应混合液置于95℃水浴锅内10min将酶灭活，并将灭活后的混合液进行真空冷冻干燥后获得消化处理后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin粉末。步骤(3)所述益生菌包括且不仅限于：双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、丙酸杆菌属、片球菌属在内的细菌以及其他对人体及动物有益的细菌和真菌。步骤(4)中孵育方式为：先用含有1-10mg/mLPT-gliadin且不加血清和抗生素的RPMI1640细胞培养液孵育肠道细胞1-5h，用磷酸盐缓冲液将细胞中残留的PT-gliadin冲洗干净，再用重悬有1×105～1×1011CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI1640细胞培养液与肠道细胞共孵育1-5h。步骤(5)中细胞紧密连接检测包括：单层细胞跨膜电阻值检测、细胞连蛋白释放量检测以及细胞紧密连接蛋白表达量和定位检测；其中，PT-gliadin孵育单层细胞后，细胞跨膜电阻值降低程度超过20％视为细胞紧密连接受损，益生菌孵育后对受损肠道细胞的跨膜电阻恢复程度超过10％的为有效菌株；PT-gliadin可以引起单层细胞联蛋白释放量显著提高，益生菌处理后相比于由PT-gliadin引起的连蛋白释放量能降低25％的为有效菌株；PT-gliadin处理后会导致细胞紧密连接蛋白相对mRNA水平降低，益生菌孵育细胞后紧密连接蛋白相对mRNA水平等于或大于1的为有效菌株；PT-gliadin处理后会导致紧密连接蛋白荧光量降低，益生菌孵育后如果有明显的荧光强度回复，即为有效菌株。下面提供每一个步骤具体的操作方法和试验参数。1、肠道细胞培养人结肠癌细胞HT-29(或人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84)在RPMI1640培养基(包含10％胎牛血清，青霉素(100U/mL)，链霉素(100μg/mL))中生长，并在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养至密度105个/cm2以上。本试验使用的细胞传代数控制在50代以内。2、模拟消化环境处理麦醇溶蛋白(gliadin)和牛血清白蛋白(BSA)①精确称取60mg麦醇溶蛋白(gliadin,G3375；Sigma-Aldrich)或者60mg牛血清白蛋白(BSA,A7030；Sigma-Aldrich)，溶解于10mL的50mM醋酸钠缓冲液(pH＝4.0)；②向溶液中加入3mg胃蛋白酶(64007137；SinopharmChemicalReagentCo.,Ltd)后，置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h；③再向溶液中加入71mg无水磷酸氢二钠[Na2HPO4]，并用氢氧化钠快速调节pH至7.0，之后加入3mg胰蛋白酶(64008860；SinopharmChemicalReagentCo.,Ltd)，并将混合溶液置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h；④将以上步骤所得反应混合液置于95℃水浴锅内10min将酶灭活；⑤将灭活后的混合液进行真空冷冻干燥后获得消化处理后的麦醇溶蛋白(PT-gliadin)粉末，置于-20℃冰箱保存备用。3、益生菌培养待筛选的益生菌菌株均保存于添加了30％甘油的deMan,Rogosa,andSharpe(MRS)培养基中(难培养的如梭菌等肠道细菌可以保存在添加30％甘油的ReinforcedClostridialmedium(RCA)培养基中，酵母类真菌可以保存在添加30％甘油的YeastExtractPepton本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法，其特征在于包括下列步骤：(1)用Roswell Park Memorial Institute 1640Glutamax medium(RPMI 1640)培养基对在体外可进行培养的人或动物肠道细胞进行培养至单层细胞；所述肠道细胞包括且不限于人结肠癌细胞HT‑29、人结肠腺癌细胞Caco‑2、人结肠癌细胞T84；(2)模拟消化道环境用胃蛋白酶结合胰蛋白酶消化处理麦醇溶蛋白即gliadin，灭活后真空冷冻干燥得到消化后的麦醇溶蛋白即PT‑gliadin；(3)益生菌培养；(4)用PT‑gliadin及益生菌菌悬液先后分段对步骤(1)所得的单层肠道细胞进行孵育；(5)细胞紧密连接指标检测。
【技术特征摘要】
1.一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法，其特征在于包括下列步骤：(1)用RoswellParkMemorialInstitute1640Glutamaxmedium(RPMI1640)培养基对在体外可进行培养的人或动物肠道细胞进行培养至单层细胞；所述肠道细胞包括且不限于人结肠癌细胞HT-29、人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84；(2)模拟消化道环境用胃蛋白酶结合胰蛋白酶消化处理麦醇溶蛋白即gliadin，灭活后真空冷冻干燥得到消化后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin；(3)益生菌培养；(4)用PT-gliadin及益生菌菌悬液先后分段对步骤(1)所得的单层肠道细胞进行孵育；(5)细胞紧密连接指标检测。2.根据权利要求1所述的筛选益生菌的方法，其特征在于：步骤(2)的详细操作方法为：称取60mg的麦醇溶蛋白溶解于10mLpH＝4.0的50mM醋酸钠缓冲液，向溶液中加入3mg的胃蛋白酶后，置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，再向溶液中加入71mg无水磷酸氢二钠，并用氢氧化钠快速调节pH至7.0，之后加入3mg胰蛋白酶，并将混合溶液置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，所得反应混合液置于95℃水浴锅内10min将酶灭活，并将灭活后的混合液进行真空冷冻干燥后获得消化处理后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin粉末。3.根据权利要求1所述的筛选益生菌的方法，其特征在于：步骤(3)所...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，王刚，许奇，田丰伟，张秋香，刘小鸣，范大明，赵国忠，张白曦，翟齐啸，毛丙永，郭敏，杨波，陆文伟，赵建新，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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