玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光检测试剂盒及使用方法技术

一种用于玉米内州萎蔫病菌检测的环介导等温扩增试剂盒及使用方法，其特征在于，所述试剂盒由玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组溶液、反应预混液、玉米内州萎蔫病菌阳性样品及阴性样品构成；所述引物组，其特征在于，由玉米内州萎蔫病菌16SrDNA保守区域设计而成，包括一对内引物(FIP，BIP)和一对外引物(F3，B3)，可用于直接荧光目视方法、紫外光照射荧光目视方法、凝胶电泳方法、实时荧光检测方法、实时浊度检测方法及微全分析方法；所述试剂盒的使用方法，其特征在于，可通过环介导等温扩增荧光检测系统进行玉米内州萎蔫病菌实时检测。本发明专利技术提供了玉米内州萎蔫病菌快速定性和定量检测手段，特异性好，简便快速，可用于现场即时检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于植物致病菌快速检测的LAMP引物、试剂盒及其使用方法。尤其涉及一种用于玉米内州萎蔫病菌的LAMP引物、试剂盒及其使用方法，属于植物性病菌检测领域。
技术介绍
玉米内州萎蔫病菌(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskense)是一种革兰氏阳性，无鞭毛，不固酸的严格好养性棒状杆菌。其是一种造成严重农业经济损失的植物病害，最早于1969年在美国内布拉斯加州中部和东部的马齿型玉米上发现，之后相继在爱荷华州西部、堪萨斯州、南达科塔州及科罗拉多州等地发生，2000年已经扩散至加拿大的安大略湖区。该病菌对玉米生产有严重的影响，在该病害大暴发时，可导致玉米产量损失率达50％。因此，为玉米内州萎蔫病菌建立一种快速高效的检测方法具有重要意义。目前针对玉米内州萎蔫病菌常用的检测方法包括分离培养检测、酶联免疫吸附试验、免疫胶体金检测试验等，这些方法检测周期较长，灵敏度和效率偏低。分子生物学包括普通PCR，实时荧光定量PCR，DNA探针技术等，但这些方法对操作人员素质要求高，及其易于污染，且造价高昂，难以进行大批量的检测。环介导等温扩增(LAMP)法是2000年由日本Notomi博士专利技术的一种新的核酸扩增技术，其具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。经过十几年的发展，该方法得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污染，尤其适合于现场快速检测。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供了一套用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增引物组，可用于玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光反应扩增的快速检测。引物组中的各引物可按一定比例配制成引物组溶液，用于制备玉米内州萎蔫病菌快速检测的试剂盒，其中内引物与外引物的浓度比例确定方法为，分别按内引物与外引物的浓度比例为2∶1-12∶1配制引物组溶液，构成环介导等温扩增反应体系，通过观察出峰时间得出，内引物与外引物的最佳比例为6∶1。所述的环介导等温扩增反应预混液，可以是使扩增产物发出荧光信号的一种商品化试剂盒IsothermalMastermix或者等效的其他试剂盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSO4和缓冲溶液构成。试剂盒中还同时引入一组阳性样品和阴性样品，阳性样品是由玉米内州萎蔫病菌人工合成片段构建的重组质粒，其浓度均为1ng/μL，阴性样品是不含玉米内州萎蔫病菌基因组的介质溶液。本专利技术还提供一种用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增试剂盒的使用方法，其特征在于，将玉米内州萎蔫病菌加入到环介导等温扩增反应体系，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩增并实时监测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线。所述的环介导等温扩增实时荧光反应25μL反应体系包括：环介导等温扩增反应预混液15μL，DEPC水2μl，引物组混合液7μl，DNA模板1μl，阴性对照中以阴性样品代替DNA模板。扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号且溶解曲线为单一尖锐峰的判定位阳性结果；扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号但溶解曲线不是单一锐锋的判定为非特异性扩增；扩增曲线平台荧光值低于本底噪音信号的判定为阴性结果。环介导等温扩增荧光检测系统的扩增程序为：①64℃，60min，②98℃-80℃，0.05℃/s，10min。一种用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增试剂盒的使用方法，还包括灵敏度的检验，其方法为，用DEPC水稀释玉米内州萎蔫病菌的阳性样品(1ng/μL)，浓度梯度为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，进行灵敏度实验，通过环介导等温扩增荧光检测系统实现等温扩增并实时监测反应管中的荧光信号，得出其灵敏度。附图说明图1溶液中内、外引物摩尔浓度比的优化图。其中管1-6中内、外引物摩尔浓度配比为2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1；管7为阴性对照。图2LAMP法检测反应温度结果图。其中管1-8反应槽所设置温度为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃。图3LAMP法检测玉米内州萎蔫病菌灵敏度反应结果图。其中管1-7分别为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg；8为阴性对照。图4PCR检测玉米内州萎蔫病菌灵敏度反应结果图。其中M为DNAmarkerl；1-5分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg；6为超纯水。图5LAMP法检测玉米内州萎蔫病菌特异性的扩增曲线图。其中1-7分别是玉米内州萎蔫病菌，玉米细菌性枯萎病菌，玉米细菌性叶斑病，马铃薯环腐病菌，苜蓿细菌性萎蔫病菌，小麦苗枯病菌，番茄溃疡病菌；8为阴性对照。图6LAMP法检测玉米内州萎蔫病菌特异性的溶解曲线图。其中1-7分别是玉米内州萎蔫病菌，玉米细菌性枯萎病菌，玉米细菌性叶斑病，马铃薯环腐病菌，苜蓿细菌性萎蔫病菌，小麦苗枯病菌，番茄溃疡病菌；8为阴性对照。具体实施方法下面结合附图，对本专利技术的具体实施方法做进一步详细描述，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1.试验材料与方法1.1试验材料玉米内州萎蔫病菌(Clavibactermichiganensissubsp.Nebraskensis)、玉米细菌性枯萎病菌(Pantoeastewartiisubsp.stewartii)、玉米细菌性叶斑病(Acidovoraxavenaesubsp.avenae)、马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus)、苜蓿细菌性萎蔫病菌(Clavibactermichiganensissubsp.Insidiosus)、小麦苗枯病菌(Clavibacterfangii)、番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)均购自美国ATCC。1.2引物设计运用在线软件PrimerExplorerV4(http：//primerexplorer.jp/e/)设计玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增实时荧光检测方法的特异性引物组(表1)：包括一组内引物(FIP，BIP)和一对外引物(F3，B3)，其引物序列为：1.3重组质粒的提取及验证在3mL预先加入氨苄青霉素的LB培养基中接入100uL的甘油菌液，37℃，160rpm振荡培养8-10h，参照质粒小提试剂盒的说明提取质粒，进行测序鉴定，其余菌液加入30％甘油后放入-80℃保存。用Nanophotometer仪器测量质粒浓度。1.4引物组溶液中内、外引物摩尔浓度比的优化引物组溶液的内外引物摩尔浓度比例分别为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，进行环介导等温扩增实时荧光反应，根据获得扩增曲线的时间来确定内外引物摩尔数的最优比例。1.5环介导等温扩增实时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一套用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增引物组，其特征在于，可用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增反应。所述玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组，其特征在于，包括一组内引物(FIP，BIP)和一对外引物(F3，B3)，其引物序列为：。

【技术特征摘要】
1.一套用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增引物组，其特征在于，可用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的环介导等温扩增反应。所述玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组，其特征在于，包括一组内引物(FIP，BIP)和一对外引物(F3，B3)，其引物序列为：。2.如权利1中所述的玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组，其特征在于，用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的方法包括：1)直接荧光目视方法，其特征在于，在扩增反应前向体系中加入钙黄绿素作为荧光指示剂，可直接通过肉眼观测结果，反应管中反应液呈绿色的为阳性结果，不呈绿色的为阴性结果；2)紫外光照射荧光目视方法，其特征在于，扩增反应后反应管中反应液在紫外光照射下，呈红色荧光的为阳性结果，不呈红色的为阴性结果；3)凝胶电泳方法，其特征在于，反应后反应液电泳时有特征梯形条带者为阳性结果，无特征梯形条带者为阴性结果；4)实时荧光检测方法，其特征在于，反应时实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，进而判定检测结果；5)实时浊度检测方法，反应时实时监测反应管中的浊度信号，获得等温扩增曲线，进而判定检测结果；6)微全分析方法，其特征在于，样品裂解、核酸提取纯化、等温扩增和检测均集成在微全分析系统上自动完成，结果判定方法包括前述的直接荧光目视方法、紫外光照射荧光目视方法、凝胶电泳方法、实时荧光检测方法、实时浊度检测方法，该微全分析系统由微膜片泵(阀)驱动，通过程序控制微膜片泵(阀)的开启与闭合实现微流体样品的驱动控制。3.一种如权利要求1所述的玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组用于玉米内州萎蔫病菌快速检测的试剂盒，主要由玉米内州萎蔫病菌环介导等温扩增引物组溶液、...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹明强，薛强，杨玲辉，邹骏，李莉，
申请(专利权)人：中检国研北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11