一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用，属于细菌检测技术领域。一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。本发明专利技术检测方法快速、灵敏高、准确性好。

【技术实现步骤摘要】
一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用
本专利技术涉及细菌检测
，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用。
技术介绍
牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）为巴氏杆菌科巴氏杆菌属成员，革兰氏阴性菌，显微镜下观察为短小的杆状或者球状，两端钝圆、没有鞭毛、不形成芽孢。生化特性为需氧或兼性厌氧、对营养的要求较高；可分解甘露糖、葡萄糖、蔗糖和果糖、产酸不产气。有荚膜的菌株抗性较强，多见于临床病料新分离菌株。该菌易感染月龄较小的犊牛，引起地方性的新生犊牛肺炎、运输热或者断奶牛肺炎；实际生产中这些疾病的产生通常伴随着各种应激因素，如不利的气候影响、不良的营养状况、长途运输等。尤其是该菌在呈急性感染时会表现为出血性败血症，导致病畜迅速死亡。目前根据细菌的荚膜血清反应将该菌可以分为A、B、D、E和F5种荚膜血清型，其中临床上对牛有致病性的为A、B和E型。至2006年报道分离A型菌株以来，我国其它地区如天津、宁夏、内蒙古、新疆、湖北、吉林和山东等地也相继报道分离了A型菌株，表明我国从北部到中部都存在该病的流行。由于该病对养牛业的危害极大，因此对该病的诊断就显得尤为重要。传统的牛多杀性巴氏杆菌检测方法主要是通过实验室手段进行细菌的分离和相关的生化鉴定、血清学鉴定；近些年也出现了常规PCR鉴定、套式PCR鉴定和荧光定量PCR鉴定。这些方法往往存在需要精密仪器和特殊实验条件的限制，制约了现地应用。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在基层推广应用，具有很强的临床意义。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是一种新颖的恒温核酸扩增方法，它是一种灵敏的链置换技术，可以在恒温条件下和短时间内将目标DNA从几个拷贝扩增到109~1010拷贝。LAMP技术的基本原理是针对靶序列的6个区域，设计4条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶-BstDNApolymerase在等温条件下进行反应。同一链上的一组引物顺序地退火到靶序列，在链置换DNA聚合酶的作用下，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链。置换发生在两条链上，对引物设计的要求是能形成环状结构。反应在恒温条件下进行，链的变性是由链置换产生的。LAMP反应形成一系列不同长度茎环结构的DNA再通过特定的方法判断扩增与否。该方法具有方便快速、操作简单、敏感性高、适用性强、结果准确等特点，而且对实验所用的仪器要求非常低，一台普通的水浴锅就可以完成全部实验反应。为了实现牛多杀性巴氏杆菌的快捷、准确和简易检测诊断，很有必要提供一种利用LAMP技术检测牛多杀性巴氏杆菌的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测方法，使其能够快速、准确地对疑似样品进行检测，以克服现有方法在临床实用性上的不足。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。本专利技术提供了上述牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包含检测溶液，每24μL检测溶液中包括：10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL正向内引物FIP1.0μmol/L反向内引物BIP1.0μmol/L正向外引物F30.4μmol/L反向外引物B30.4μmol/LMgSO41.0mmol/LdNTP1.6nmol/LBstDNA聚合酶320000U/L显色试剂3mmol/LDEPC水补足至24μL，其中，各引物的序列分别为：FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。优选地，所述显色试剂为羟基萘酚蓝，在恒温扩增反应前加入。本专利技术提供了上述牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。本专利技术提供了利用上述牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测牛多杀性巴氏杆菌的方法，包括以下步骤：步骤S1：当原始病料样品为液体样本时，取所述液体样本1mL在12000rpm/min条件下离心2min后起弃掉上清，再用PBS缓冲液1mL重悬沉淀，12000rpm/min条件下离心2min后再次弃掉上清；然后利用100μLPBS缓冲液将沉淀吹悬后，取1μL作为样品模板DNA；当原始病料样品为固体样本时，取所述固体样品的病变与正常交界处的组织0.5g，加入10倍的PBS缓冲液无菌研磨，冻融2次后无菌纱布过滤，然后将获得的滤液采用前述液体样本的方法进行处理，得到样品模板DNA；步骤S2：取1μL的样品模板DNA加入24μL环介导等温扩增检测试剂盒中的检测溶液，62℃恒温反应1小时；步骤S3：观察反应结束后溶液的颜色变化，阳性结果显示为天蓝色，阴性结果显示为紫色。优选地，所述样品模板DNA，是疑似感染牛多杀性巴氏杆菌的患病动物组织样品的基因组。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：采用LAMP技术设计的4条引物分别针对6个不同的区域，任何一个不匹配反应就无法进行。本专利技术所设计的4条引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，分别针对靶序列上的6个独立区域。其中正向内引物是FIP，包括F1c区段（同靶序列的F1c区段完全相同）、F2区段（同靶序列的F2c区段完全相同）和TTTT连接子；正向外引物是F3，该基因与靶序列的F3c区段完全互补；反向内引物BIP，包括B1c区段（同靶序列的B1c区段完全相同）、B2区段（同靶序列的B2c区段完全相同）和TTTT连接子；反向外引物B3，同靶序列上的B3c区段完全互补。本专利技术所设计的4条引物分别针对靶序列上6个不同的区域，从而保证反应的强特异性性。本专利技术牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测方法，包括提取样品模板DNA，利用所述环介导等温扩增引物组合物进行环介导等温扩增；羟基萘酚蓝(hydroxylnaphtholblue，HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测环介导等温扩增反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与环介导等温扩增反应的副产物P2O74-结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

【技术特征摘要】
1.一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。2.如权利要求1所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。3.一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：包含检测溶液，每24μL检测溶液中包括：10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL正向内引物FIP1.0μmol/L反向内引物BIP1.0μmol/L正向外引物F30.4μmol/L反向外引物B30.4μmol/LMgSO41.0mmol/LdNTP1.6nmol/LBstDNA聚合酶320000U/L显色试剂3mmol/LDEPC水补足至24μL，其中，各引物的序列分别为：FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：史鸿飞，阚云超，姚伦广，唐存多，焦铸锦，冷超粮，冀君，岳超，马娜，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41