本发明专利技术公开一种猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细环病毒1型DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。其应用包括使用该试剂盒检测猪细环病毒1型病变组织样品和猪细环病毒1型病原定性研究。特异性检测和敏感性检测证实，本发明专利技术提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出猪细环病毒1型的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪细环病毒1型带来便利。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测
，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪细环病毒1型的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
猪细环病毒(Torquetenosusvirus,TTSuV)是一种无囊膜，单股负链的环形DNA病毒，根据其核苷酸序列差异可将TTSuV分为两个亚型即TTSuV1和TTSuV2，都属于指环病毒科(Anelloviridae)，壬型指环病毒属(Iotatorquevirus)，由日本学者Nishizawa等于1997年在输血后的肝炎患者的血清中发现。但TTV宿主范围非常广泛，除了能感染常见的家禽家畜外，也能感染包括人和其他灵长类动物。不同年龄段的猪群均对猪细环病毒(Torquetenosusvirus，TTSuV)易感，我国猪群感染率大致在24%～100%，其中根据王礞礞等于2008～2009年间采集了来自中国6个省市的发病猪和健康猪样本的检测结果显示，TTSuV1感染率约为37.6％，TTSuV2感染率约为82.6％，二者混合感染率为38.4％。到现今为止，人们仍不清楚TTSuV的致病性，目前研究只了解到TTSuV与猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)等病毒存在某种协同作用，当发生混合感染时会加重断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎肾病综合症的症状。对猪细环病毒1型的密切监测和快速诊断，有利于该病及其他协同感染疾病的防治。当前，可通过常规PCR、荧光定量PCR、和套式PCR等技术手段来检测TTSuV1的存在，但这些技术在运用上尚存在着一些不足，并且对硬件方面有较高要求，在结果判定上还需进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，用时也较长，不适合基层和现场检测。因此建立一种简单且灵敏的TTSuV1检测方法，具有一定的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪细环病毒1型的方法，公开一种快速、实时定量的检测猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括TTSuV1-LAMP引物、2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和TTSuV1-DNA模板，所述的TTSuV1-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；其中引物的序列分别为：F3AAGACCCCGCCAAGGTACB3CACTGCTCGTGCTTGAGATFIPTGTGGGGAGTTCGAGCAGTCTTCAGTCCTCAACCCTTGGGABIPGGAGGAGACGGAGAAGGCGTGCTCTCTTCGTCGGAGTCTLFGTTCTAACAATCCTGTCACAGTCATLBACCCACTCCTTGGACAAAAGA所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。所述的猪细环病毒1型DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的疑似感染猪细环病毒1型的临床病变组织中的基因组DNA。所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgSO415-28mM、(NH4)2SO418-28mM、Tween200.5-1.5℅、Betaine1.3-3.5M和dNTPs2.4-4.8mM，其配制方法在pH为8.6左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。一种猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒的应用，兽医临床上用于检测疑似猪细环病毒1型病变组织或培养物中是否含有猪细环病毒1型，具体检测步骤包括：（1）LAMP引物的设计与合成（2）猪细环病毒1型DNA模板的提取（3）LAMP反应体系建立（4）LAMP检测方法。所述的LAMP反应体系建立以25μL计，2×反应缓冲液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmolLF20pmolLP20pmol猪细环病毒1型DNA2μL超纯水补足25μL。所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在18-25分钟间出现扩增。本专利技术的实质性特点和显著的进步是：1）特异性强本专利技术的LAMP方法特异性检测出猪细环病毒1型，所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。2）灵敏度高普通PCR检测方法的灵敏度为9.25×10-6ng/μL，而使用本专利技术的LAMP检测方法，检测限约为9.25×10-8ng/μL，是普通PCR的100倍。3）迅速获得结果普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析来判读结果，从基因组DNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本专利技术提供的LAMP检测方法反应在19分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。4）不造成污染目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本专利技术的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖。此外，本专利技术的LAMP检测方法在结果判读上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。5）可实时定量本专利技术利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物，其引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；其中引物的序列分别为：F3 AAGACCCCGCCAAGGTACB3 CACTGCTCGTGCTTGAGATFIP TGTGGGGAGTTCGAGCAGTCTTCAGTCCTCAACCCTTGGGABIP GGAGGAGACGGAGAAGGCGTGCTCTCTTCGTCGGAGTCTLF GTTCTAACAATCCTGTCACAGTCATLB ACCCACTCCTTGGACAAAAGA。
【技术特征摘要】
1.一种猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物，
其引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP
（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；
其中引物的序列分别为：
F3AAGACCCCGCCAAGGTAC
B3CACTGCTCGTGCTTGAGAT
FIPTGTGGGGAGTTCGAGCAGTCTTCAGTCCTCAACCCTTGGGA
BIPGGAGGAGACGGAGAAGGCGTGCTCTCTTCGTCGGAGTCT
LFGTTCTAACAATCCTGTCACAGTCAT
LBACCCACTCCTTGGACAAAAGA。
2.根据权利要求1所述的猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的
试剂盒还包括2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细环病毒1
型DNA模板；所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine
和dNTPs。
3.根据权利要求2所述的猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的
荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4.根据权利要求2所述的猪细环病毒1型环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2
×反应缓冲液包括Tris-HCL3...
【专利技术属性】
技术研发人员：何颖，陈忠伟，赵武，秦毅斌，卢冰霞，李斌，段群棚，周英宁，梁家幸，杨思仪，蒋冬福，苏乾莲，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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