一种埃博拉病毒一步法核酸定量RT-PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了埃博拉病毒一步法核酸定量RT-PCR检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、EBV核酸定量引物探针、内参、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照、校准品1号~5号。本发明专利技术可对提取好的EBV RNA直接进行一步法RT-PCR反应，对样本中的EBV RNA进行荧光定量检测，并依靠内参基因序列作为内对照、利用UNG酶预防污染。本发明专利技术的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便、预防污染，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，可用于血清中埃博拉病毒核酸定量检测。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术属生物
，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于埃博拉病毒核酸的荧光定量检测的试剂盒。

技术介绍

埃博拉病毒（Ebolavirus,EBV）属于丝状病毒科（Filoviridae），是一种能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热（Ebolahemorrhagicfever,EBHF）的烈性传染病病毒，病毒潜伏期可达2至21天，但通常只有5天至10天；罹患此病可致人于死，包含数种不同程度的症状（包括恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等），感染者症状与同为纤维病毒科的马尔堡病毒（Marburgvirus）极为相似，具有50%至90%的致死率，致死原因主要为中风、心肌梗塞、低血容量性休克或器官衰竭。EBHF在几个世纪前即流行于中非热带雨林地区和东南非洲热带大草原，目前在非洲大陆的许多国家均报道了本病。EBHF疫源地主要在非洲大陆，美国、泰国、英国、加拿大等国也有本病流行的血清学证据。迄今为止，EBV已发现有5个亚种，分别为：
Zaireebolavirus（EBOV）(扎伊尔埃博拉病毒，1976）-标准亚种
Sudanebolavirus（SUDV）(苏丹埃博拉病毒，1998）
Restonebolavirus（RESTV）(雷斯顿埃博拉病毒，2002）
Ta?Forestebolavirus（TAFV）(科特迪瓦埃博拉病毒，2010）
Bundibugyoebolavirus（BDBV）(邦地布优埃博拉病毒，2012）
每个EBV病原体是由链状的负链核糖核酸（RNA）病毒粒子构成。3'-端没有多聚腺苷酸化，5'-端也没有加帽（capping）。基因组编码七个结构蛋白和一个非结构蛋白。
EBV基因顺序是：3'-端-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5'-端，两端的非编码区含有重要的信号以调节病毒的转录、复制和新病毒颗粒的包装。如果缺少相应的蛋白，单基因组本身并不具备感染性，其中一种蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，是病毒基因组转录成信使RNA所必须的酶，它对病毒基因组的复制也有重要作用。其所编译的蛋白中，NP是核衣壳蛋白，VP30和VP35是病毒结构蛋白，VP35具有抗I型干扰素作用，GP是跨膜糖蛋白，与病毒的入侵过程及细胞毒性有关，VP24和VP40与病毒的成熟释放有关，前者是小型膜蛋白，后者是病毒基质蛋白。
EBV是人畜共患病毒，主要的感染途径是透过患者体液传染，如血液、汗、呕吐物、排泄物、尿液、唾液或精液等，目前并无飞沫感染的证据。尽管世界卫生组织苦心研究，至今仍没有辨认出任何有能力在爆发时存活的动物宿主，目前认为果蝠是病毒可能的原宿主。因为埃博拉的致命性，加上目前尚未有任何疫苗被证实有效，EBV被列为生物性危害第四级病毒（艾滋病为3级，SARS为3级，级数越大防护越严格），也同时被视为是生物恐怖主义的工具之一。
目前，对EBV的临床诊断方法，可用免疫荧光方法（IFA）检测培养细胞中的病毒抗原，用乳鼠脑内接种分离和鉴定病毒等。血清学诊断方法还有空斑减少中和试验（PRNT）等。应用组织学、免疫细胞化学及超微结构检查等方法研究发现，感染EBV后猴皮脂腺周围血管结构抗原阳性，提示可用病人含汗腺皮肤作为实验诊断材料。酶联免疫吸附试验（ELISA）是确诊疑似病例的首选方法，其次可选用逆转录套式-聚合酶链式反应（RT-PCR）。福尔马林保存的死者皮肤用免疫组化试验（IHC）检测抗原，可用于诊断和监测，此法不需冷藏保存标本，操作安全。这些方法均可在不具备P4级安全防护条件下进行。特异性IgM和IgG抗体约在患病初期（8～10d）出现，故对发病初期的可疑病例检查抗原和分离病毒更可靠，因为这种急性高病死率的疾病在病死前有的还查不到抗体。
EBV是高度危险的病原体，必须在P4级的高度安全实验室内进行病毒的分离与鉴定。在非洲疫区主要通过检测埃博拉病毒的特异性IgM和IgG抗体以及检查病毒抗原或核酸等进行诊断。
由于对于EBV的病理不详，所以无有效治疗手段。目前对EBHF无特效治疗药物，主要为对症治疗，重症病例需给予支持性护理，因病人常脱水，需静脉输液，可考虑使用大剂量干扰素及抗血清。抗EBV免疫血清球蛋白G对志愿者使用证明安全有效。使用免疫血清中止治疗后对动物无长期保护作用。
2014年8月9日，中国宣布已掌握埃博拉病毒抗体基因，同时具备对埃博拉病毒进行及时检测的诊断试剂研发能力。
当前，基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了PCR高敏感性、DNA杂交技术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法，该方法取材简单，操作方便，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染，能简便、快速、高特异、高敏感、定量、无污染地检测埃博拉病毒，还可以以量化指标来评估病毒相关指标。因此，荧光定量PCR法是临床早期诊断EBV感染的最有价值的方法之一。
TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’-末端，淬灭基团在探针3’-末端。当探针完整及其与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，TaqDNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了PCR污染等问题。EBVRNA荧光定量检测正是基于这种原理设计，为EBV早期感染诊断、大规模筛查、疗效动态分析、新药开发等提供良好的技术支持。目前，国内外尚无已上市的有关EBV核酸定量检测试剂；本试剂盒的开发成型可填补该方面技术和产品的空白。
同时，为避免反应结果的假阳性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP；而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前易于被UNG酶降解：这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或双链DNA中消除dUTP而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶对不含dUTP的模板无任何影响，因此，反应体系中只有从EBV阳性病人样本血清中提取的EBVRNA因不被UNG酶降解而直接进行RT-PCR反应。
而且，将人造的非竞争性内参RNA（慢病毒）引入反应体系，以指示每个PCR反应管的扩增情况，从而避免假阴性或部分抑制结果的出现。
综上所述，利用TaqMan探针技术对EBV进行核酸定量检测对于病毒感染、传播、诊断等方面均有重要意义，可作为EBV感染的诊断和重要的预后和监测指标。
该技术通过对EBV各基因亚型序列比对分析，获得针对EBV核酸定量通用引物及特异性的荧光探针，通过检测含EBV各基因亚型基因组序列的慢病毒的血清，确定该试剂盒的各种检测指标——特异性、灵敏度等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种埃博拉病毒一步法核酸定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于：本专利技术通过考察已知EBV基因组全序列，并根据检索所得EBV不同基因亚型一致性保守序列设计出一对EBV通用定量引物、一条EBV特异性荧光探针，及一对内参特异性引物和一条内参探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。

【技术特征摘要】
1.一种埃博拉病毒一步法核酸定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察已知EBV基因组全序列，并根据检索所得EBV不同基因亚型一致性保守序列设计出一对EBV通用定量引物、一条EBV特异性荧光探针，及一对内参特异性引物和一条内参探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。
2.权利要求1所述的埃博拉病毒一步法核酸定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：EBV基因特异性定量序列和内参基因序列分别为：
〈SEQIDNo.1〉
5’-CCATTGCAAAATTAGAGGATGTAGATGTGTCTGATTATCCTGACCCGAGTGATATTCTTAAGATATACAATGCTGGAGACTATGTAATATCTATTCTTGGCTCAGAGGGTTATAAGATAATAAAGTACCTTGAACCA-3’，
〈SEQIDNo.2〉
5’-CATTGCTTCCATTGATGGCTTAAAGGACACCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTTCACGTGCGCTGCYGAAGATCAAA-3’，
EBV一步法核酸定量RT-PCR检测试剂盒中核酸定量扩增基因序列全长137bp，属EBV基因组中VP30结构基因区，为单拷贝序列；内参基因序列全长137bp，与EBV核酸扩增基因序列有所不同。
3.如权利要求1所述的埃博拉病毒一步法核酸定量RT-PCR检测试剂盒，一对EBV核酸通用定量引物序列中的一条序列与SEQIDNo.1中所示的序列相同，另一条引物序列与SEQIDNo.1中所示的序列互补；EBV核酸定量特异性探针与SEQIDNo.1中所示的序列相同；内参特异性引物序列中的一条序列与SEQIDNo.2中所示的序列相同，另一条引物序列与SEQIDNo.1中所示的序列互补；内参特异性探针与SEQIDNo.2中所示的序列相同。其中，所述的一对EBV核酸通用定量引物，其序列可以选自SEQIDNo.3和SEQIDNo.4，
〈SEQIDNo.3〉为：5’-CCATTGCAAAATTAGAGGATGT-3’，
〈SEQIDNo.4〉为：5’-TGGTTCAAGGTACTTTATTAT-3’；
一对EBV核酸通用定量引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上；所述的EBV核酸定量特异性探针，可以选自SEQIDNo.5的序列，
〈SEQIDNo.5〉为：5’-FAM-CTGATTATCCTGACCCGAGTGATATT-BHQ-3’，
其中，探针5’-端标记FAM荧光基团，探针3’-端均标记淬灭基团。...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟大利，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31