一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒技术

本发明专利技术提供一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒，该方法采用多对引物、多条探针的荧光核酸扩增方法，可在单管中实现多种靶核酸序列检测。该发明专利技术以新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因以及E基因为靶序列设计特异性引物和TaqMan探针，通过多通道荧光PCR扩增检测新型冠状病毒。本发明专利技术优化引物探针设计、反应体系和扩增程序，70分钟即可完成荧光检测，试剂盒灵敏度达到200copies/mL。

A novel coronavirus detection method and kit

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒
本专利技术为一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒，属于生物

技术介绍
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前末在人类中发现的新型冠状病毒，即2019新型状病毒。2020年2月7日，国家卫健委決定将“新型冠状病毒感染的肺炎“暂命名为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”。2月11日，世界卫生组织(WHO)将其英文名称为CoronaVirusDisease2019(COVD-19)。2月22日，国家卫健委決定将『“新型冠状病毒肺炎”英文名称修订为＂COVID-19”，与世界卫生组织命名保持一致，中文名称保持不变。2020年1月30日，WHO直布将新型冠状病毒肺炎疫情列为国际关注的突发公共卫生事件(PHEC)。患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸着迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。目前缺乏针对病原体的有效抗病毒药物，以隔离治疗、对正支持治疗为主。本专利技术提供一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒，该方法采用多多重荧光PCR扩增进行新型冠状病毒鉴别检测。根据TaqMan引物探针设计原则，选择在新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因和E基因为靶序列设计特异性引物和探针，通过多通道荧光PCR扩增检测新型冠状病毒。本专利技术还引入内源性的内参照系统，用于监测样本取样质量以避免检测结果的假阴性。和现有流感病毒、新型冠状病毒核酸检测公开技术比较，本专利技术的检测结果稳定可靠，试剂盒使用方便，检测灵敏度高。<br>
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种新型冠状病毒检测方法，另一目的是提供一种新型冠状病毒检测试剂盒。本专利技术中新型冠状病毒检测分别基于新型冠状病毒的ORF1ab、N基因和E基因设计引物探针，优选的靶序列分别为：SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12，并根据靶序列分别新型冠状病毒ORF1ab、N基因和E基因特异性引物和探针序列，引物序列分别为：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8，探针序列分别为SEQIDNo.3、SEQIDNo.6、SEQIDNo.9，TaqMan探针5’端分别标记不同的荧光基团标记（FAM、VIC/JOE/HEX、ROX/TEXASRED或者CY5），3’端均标记相同的BHQ淬灭基团。本专利技术还提供一种人内源性内参照系统，内参引物为SEQIDNo.13、SEQIDNo.14，内参探针为SEQIDNo.15，内参探针5’端均标记与目的检测探针不同的荧光基团标记（FAM、VIC/JOE/HEX、ROX/TEXASRED或者CY5），3’端标记BHQ淬灭基团。本专利技术提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，采用多重荧光PCR对新型冠状病毒核酸定性检测。在使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：通用型））对咽拭子或痰液样本进行全自动核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，并通过扩增曲线进行结果分析，反应体系配制方便，PCR产物无需开盖分析，并且体系中引入了dUTP-UNG酶系统防止PCR产物污染。本专利技术提供了一种新型冠状病毒检测方法，同时提供了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。1.实时荧光PCR引物的设计通过对文献检索、NCBI下载病原体序列分析确定：分别基于新型冠状病毒的ORF1ab、N基因和E基因设计引物探针，进行引物优化设计。荧光PCR扩增检测技术中引物设计的规则为：(1)避免引物自身或引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发夹结构；(2)典型的引物18-24个核苷酸长，引物需足够长，保证序列独特性,并降低非特异性；(3)Tm值在55~65℃，GC含量在40%-60%；(4)引物之间的Tm值避免相差2℃；(5)引物的3’端避免使用碱基A，引物3’端避免出现3个或者3个以上连续相同的碱基；(6)TaqMan探针技术要求片段长度在50-250bp之间；(7)引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。按照荧光PCR设计的原则，基于新型冠状病毒的ORF1ab、N基因和E基因设计引物序列如下：上游引物为：5’-AATGATGATACTCTCTGACGATGCTGTTG-3’如SEQIDNo.1所示；5’-GGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTG-3’如SEQIDNo.4所示；5’-GTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACG-3’如SEQIDNo.7所示；下游引物为：5’-CATTGTTTTGATAATAAAGAACTGACTTAAAG-3’，如SEQIDNo.2所示；5’-CAGCAAAATGACTTGATCTTTGAAATTTGG-3’，如SEQIDNo.5所示；5’-ACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAG-3’，如SEQIDNo.8所示。2.Taqman荧光探针的设计TaqMan探针设计原则为：(1)探针长度应在15bp-45bp(最好20-30bp)，保证结合特异性；(2)探针的DNA折叠和二级结构尽量避开；(3)Tm值在65-70℃,通常比引物Tm值高5-10℃(至少5℃)，以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在40%-60%；(4)探针的5’端尽量避免使用G鸟嘌呤；(5)整条探针中碱基C的含量要明显高于G含量。分别基于新型冠状病毒的ORF1ab、N和E基因设计引物探针，扩增片段分别为：SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12，设计的TaqMan探针序列分别为：SEQIDNo.3、SEQIDNo.6、SEQIDNo.9。新型冠状病毒ORF1ab基因探针序列为：5’-GTTTCAATAGCACTTATGCATCTCAAGGTCTAGT-3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ1，如SEQIDNo.3示；新型冠状病毒N基因探针序列为：5’-GACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGAC-3’，5’端标记JOE，3’端标记BHQ2，如SEQIDNo.6示；新型冠状病毒E基因探针序列为：5’-GAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGT-3’，5’端标记ROX，3’端标记BHQ2，如SEQIDNo.12所示。3.内参照系统设计本专利技术中按TaqMan探针荧光PCR原则设计了内源性内参照系统，用于监测样本的取样、提取和扩增，避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参引物和探针，根据TaqMan荧光PCR设计原则，设计的引物和探针序列如下：5’-CATGCCAATTCCCTAAAATGTAAG-3’，如SEQIDNo.13示；5’-GACCTCAGCCAGTCCTCCAC-3’，如SEQIDNo.14示；5’-TCTGCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒，其特征在于，分别采用新型冠状病毒ORF1ab基因特异性引物和探针SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和探针SEQ ID No.3，新型冠状病毒N基因特异性引物和探针SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和探针SEQ ID No.6，新型冠状病毒E基因特异性引物SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和探针SEQ ID No.9，要求TaqMan探针SEQ ID No.35’端标记FAM基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，要求TaqMan探针SEQ ID No.6 5’端标记JOE基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，要求TaqMan探针SEQ ID No.9 5’端标记ROX基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，通过多通道荧光PCR扩增技术在单管反应中实现新型冠状病毒检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒，其特征在于，分别采用新型冠状病毒ORF1ab基因特异性引物和探针SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和探针SEQIDNo.3，新型冠状病毒N基因特异性引物和探针SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和探针SEQIDNo.6，新型冠状病毒E基因特异性引物SEQIDNo.7、SEQIDNo.8和探针SEQIDNo.9，要求TaqMan探针SEQIDNo.35’端标记FAM基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，要求TaqMan探针SEQIDNo.65’端标记JOE基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，要求TaqMan探针SEQIDNo.95’端标记ROX基团、探针3’端标记荧光淬灭基团，通过多通道荧光PCR扩增技术在单管反应中实现新型冠状病毒检测。


2.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，所用新型冠状病毒检测ORF1ab基因、N基因以及E基因为靶序列分别为SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12，设计的引物SEQIDNo.1/SEQIDNo.2、SEQIDNo.4/SEQIDNo.5、SEQIDNo.7/SEQIDNo.8分别能扩增SEQIDNo.10~SEQIDNo.12靶序列连续130～180个核苷酸，根据序列优化设计后的引物能扩增其连续90-150个核苷酸。


3.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，分别基于SEQIDNo.10～SEQIDNo.12靶序列设计的型特异性TaqMan探针SEQIDNo.3、SEQIDNo.6、SEQIDNo.9长度为22～35个核苷酸，5’端均标记不同的荧光发光基团、3’端标记荧光淬灭基团。


4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒所用的新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因和E基因引物序列可以为和SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8同源性大于85％以上的序列，TaqMan荧光探针可以为SEQIDNo.3、SEQIDNo.6、SEQIDNo.9同源性大于85...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭圣明，李丹，金捷，陆容，迟大利，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，上海复星长征医学科学有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31