一种检测艰难梭状芽孢杆菌的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了艰难梭状芽孢杆菌的基于LAMP技术的检测试剂盒。LAMP引物根据艰难梭状芽孢杆菌的特异保守序列设计，每组引物包含6条寡核苷酸。用于艰难梭状芽孢杆菌检测时，可通过肉眼观察呈白色沉淀；亦可使用恒温核酸扩增分析仪对扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号进行检测及数据处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。本发明专利技术为艰难梭状芽孢杆菌测提供了一个新的技术平台，适宜在基层单位、现场监测和床旁检测中推广应用。现场监测和床旁检测中推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测艰难梭状芽孢杆菌的试剂盒


[0001]本专利技术属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在艰难梭状芽孢杆菌检测方面的应用，即艰难梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]人体胃肠道中定植着复杂而又相对稳定的菌群，种类约500种，数量在10
14
个左右。肠道菌群比例失调，益生菌数量减少，致病菌增多能破坏肠道屏障，引起炎症反应，增加肠道感染性疾病的发生率，其中最常见的是艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile, CD）。艰难梭状芽孢杆菌广泛分布于自然界，有鞭毛，是一种有芽孢的革兰氏染色阳性厌氧杆菌，暴露于空气中艰难梭状芽孢杆菌的繁殖体会很快死亡，而芽孢在外界环境中可存活数月，耐干燥、耐热并能抵抗多种消毒剂，是唯一可引起院内感染的厌氧菌。
[0003]艰难梭状芽孢杆菌是严格的肠道厌氧菌，是造成医院性腹泻、抗生素相关性腹泻、结肠和伪膜性肠炎主要的致病因素，与其产生的毒性产物A、B毒素有关。艰难梭状芽孢杆菌不属于肠道常居菌，成人带菌率仅为5%，新生儿和婴儿高达90%。研究表明，艰难梭状芽孢杆菌感染的高危因素及该菌在临床中所引起的疾病较常见。临床上对患儿肠道粪便中艰难梭状芽孢杆菌的含量进行检测，明确此菌与疾病的相关性，进而对预防及治疗梭状芽孢杆菌引起的相关疾病提供了实验数据及临床依据。
[0004]近年来，艰难梭状芽孢杆菌在欧美蔓延趋势加快，引起当地人们重视，在我国尚未大面积流行，但应引起我们的关注。艰难梭状芽孢杆菌的检测方法一般有厌氧培养法、酶免疫法、传统PCR、组织培养细胞毒素试验等。
[0005]厌氧培养法除需昂贵的厌氧培养设备外，接种要求也比较苛刻，难于普及开展；酶免疫法虽然方便快速，但缺乏灵敏度，阳性检出率较低；传统PCR扩增完成后，需要对产物进行电泳、显影等一些繁琐步骤；组织培养细胞毒素试验虽然被认为是从粪便中检测艰难梭状芽孢杆菌的金标准，但至少需耗时24～48h的培养期，并且只能检测毒素B。因此，有必要寻找一个简单、快速、特异、全面的实验方法对艰难梭状芽孢杆菌的感染进行早期诊断。
[0006]近年来，分子生物学方法不断被应用到消化道病原体的快速检测中，消化道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了消化道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。
[0007]其中，环介导等温扩增法具有检测灵敏度高、结果判断直观，且不需要荧光定量PCR仪等价格昂贵的设备等优点，具有广泛应用前景。
[0008]环介导等温扩增技术（Loop
‑
mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型等温核酸扩增技术，具有快速、简便、经济、灵敏等优点，目前已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计3对引物（F3、B3、FIP[F1c+F2]、BIP[B2+B1c]、LF、LB），在链置换型DNA聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内（~30min）进行核酸扩增。扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，荧光信号可由仪器捕获，并进行处理
分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。与传统PCR相比，LAMP具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判定简单、成本低廉等特点。LAMP检测灵敏度至少比普通PCR高出2个数量级。此外，等温扩增仅需恒温扩增及荧光检测装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。LAMP反应结果的检测不需要像普通PCR进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察浑浊产物或者通过仪器检测荧光曲线即可，是一种高效、简便、快捷的检测方法。
[0009]因此，开发一种针对艰难梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增试剂盒对快速锁定疾病传染源、准确诊断用药、预防输入性流行病扩散具有重要的社会意义。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于：提供一种用于艰难梭状芽孢杆菌核酸检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。
[0011]1. 艰难梭状芽孢杆菌的LAMP检测专用引物根据艰难梭状芽孢杆菌基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件Primer Explorer V5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。
[0012]根据LAMP引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、GC含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的LAMP引物。具体来说，为了在反应中能使F1c和B1c更加容易弯转，可以形成双茎环结构，引物F1c和B1c要高于其他几条引物的Tm值5℃左右。为提高核苷酸越与模板退火结合效率，每条引物最末端的六个碱基自由能
⊿
G值≤
‑
4Kcal/mol，F3/B3，F2/B2，LF/LB的3
’‑
端
⊿
G值≤
‑
4Kcal/mol，F1c和B1c的5
’‑
端的
⊿
G值≤
‑
4Kcal/mol。对于引物的GC含量设定范围在40%~60%之间。对于引物之间的距离，从F2的5
’‑
端到B2的5
’‑
端应在120~180bp之间，从F2的5
’‑
端到F1c的3
’‑
端也就是茎环段在40~60bp之间，从F2的5
’‑
端到F3的3
’‑
端在0~20bp之间。最后要特别注意引物之间不能形成二级结构。通过以上设计原则筛选即得到最终引物如下。
[0013]F3: 5
’‑
GTGGGGAGCAAACAGGATT
‑3’
；B3: 5
’‑
TCTTCGCGTTGCTTCGAATT
‑3’
；FIP: 5
’‑
CGTTAGCTGCGGCACCGAAGAGTCCACGCTGTAAACGATG
‑3’
；BIP: 5
’‑
CCTGGGAAGTACGCTCGCAAACATGCTCCGCTACTTGTG
‑3’
；LF: 5
’‑
GGTAACCCCCGACACCTAGTAC
‑3’
；LB: 5
’‑
CTCAAAGGAATTGACGGGGAC
‑3’
。
[0014]2. 艰难梭状芽孢杆菌的LAMP检测方法本专利技术所提供的艰难梭状芽孢杆菌的LAMP检测方法，主要包括以下步骤：[1] 核酸提取：使用复星诊断科技（上海）有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂对待测样本进行核酸提取。
[0015][2] LAMP扩增以上述提取的待测物核酸为模板，在专用引物的介导下进行扩增。其中，LAMP反应体系（30μL）包括：待测物的基因组核酸12μL，20mM Tris
·...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile, CD）的环介导等温扩增技术（Loop
‑
Mediated Isothermal Amplification, LAMP）检测靶点：用于对艰难梭状芽孢杆菌进行快速检测的专用引物，即根据艰难梭状芽孢杆菌基因组的特异性保守靶序列设计，用以定性检测待测样品中的艰难梭状芽孢杆菌；每套引物包含6条寡核苷酸序列，即2条外引物（F3、B3），2条内引物（FIP、BIP）和2条环引物（LF、LB）。2.一种艰难梭状芽孢杆菌的LAMP检测方法，主要包括以下步骤：以待测物的基因组核酸为模板，在权利要求1所述专用引物的引导下进行LAMP扩增；扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，荧光信号可由仪器捕获，并进行处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟大利，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：