一种检测新疆出血热病毒的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了新疆出血热病毒的基于LAMP技术的检测试剂盒。LAMP引物根据新疆出血热病毒的特异保守序列设计，每组引物包含6条寡核苷酸。用于新疆出血热病毒检测时，可通过肉眼观察呈白色沉淀；亦可使用恒温核酸扩增分析仪对扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号进行检测及数据处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。本发明专利技术为新疆出血热病毒测提供了一个新的技术平台，适宜在基层单位、现场监测和床旁检测中推广应用。场监测和床旁检测中推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测新疆出血热病毒的试剂盒


[0001]本专利技术属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在新疆出血热病毒检测方面的应用，即新疆出血热病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]克里米亚
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刚果出血热（Crimean Congo hemorrhagic fever, CCHF）由克里米亚
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刚果出血热病毒（Crimean Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV）引起，是一种流行于中国新疆南部、俄国北部、中东、南部欧亚大陆及非洲撒哈拉地区的烈性传染性疾病，其平均病死率在10%~50%之间。中国的CCHF于1965年首次发现于南部新疆，其后在北疆地区亦查出抗体，故称为新疆出血热（Xinjiang hemorrhagic fever, XHF）。
[0003]新疆出血热病毒（Xinjiang hemorrhagic fever virus, XHFV）是从我国新疆塔里木地区出血热病人的血液、尸体的肝、脾、肾、淋巴结以及在疫区捕获的硬蜱中分离到的，其形态结构和抵抗力等与肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）病毒相似，但抗原性、传播方式和致病性等均与HFRS病毒不同。小白鼠、乳鼠对此病毒高度易感，可用于病毒分离和传代。目前已将该病毒归属于布尼亚病毒科的内罗病毒属（Nairovirus）的克里米亚
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刚果（Crimean
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Congo）出血热病毒组。
[0004]XHFV由4种结构蛋白组成，即2个内部蛋白（转录酶蛋白L和核衣壳蛋白N）和插在病毒膜内的2个外部糖蛋白（G1和G2）。病毒基因组为分节段的单股负链RNA，由大（L）、中（M）、小（S）3个节段组成，每个节段基因组的3'
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和5'
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末端互补，可形成环状或柄状结构。3个基因组末端11个碱基是保守的，且除第9位核苷酸外均互补，在随后的20个碱基左右显示片段特异性互补。病毒基因组（A+U）含量大于（G+C）含量，感染性基因组必须转录成正链RNA（mRNA）用于蛋白质合成。LRNA约12 Kb，编码L蛋白；SRNA约1176~2105 bp，编码N蛋白——在感染细胞中可检测到的主要的病毒蛋白——其编码策略与汉坦病毒（Hantavirus）相似，即在N蛋白基因互补RNA中只含一个开放阅读框，编码N蛋白；MRNA约414~613 Kb，编码M蛋白G2和G1，G2只在病毒成熟的末期产生，目前根据蛋白位于M片段编码蛋白的氨基或羧基末端，也分别称G2和G1为Gn和Gc；病毒基因组与2100个N蛋白和25个L蛋白紧密结合形成核衣壳。
[0005]XHF是一种自然疫源疾病，主要分布于有硬蜱活动的荒漠和牧场。牛、羊、马、骆驼等家畜及野兔、刺猬和狐狸等野生动物是储存宿主。传播媒介为亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum），实验观察到蜱可卵经传递此病毒，因此蜱又是此病毒的储存宿主。
[0006]XHF的发生有明显的季节性，每年4～5月为流行高峰，与蜱在自然界的消长情况及牧区活动的繁忙季节相符合。人被带毒蜱叮咬而感染。潜伏期7天左右，起病急骤，有发热、头痛、困倦乏力、呕吐等症状。病人早期面部、胸部皮肤潮红，继而在口腔粘膜及其他部位皮肤有出血点，严重病人有鼻出血、呕血、血尿、蛋白尿甚至休克等。病后第6天血清中可出现中和抗体，第14天达高峰，并可维持5年以上；补体结合抗体至第2周才出现，且上升缓慢，滴度也低。病后免疫力持久。
[0007]XHFV的检测方法，在实践工作中可根据不同的需要和现场（实验室）的具体条件选
择不同的方法：1. 早期快速检出病毒抗原：从急性期病人末梢血液中检测循环抗原，可采用酶联免疫吸附试验ELISA双抗体夹心法和RPHA（用McAb致敏的血球）法，前者灵敏度较高，后者检测方便、迅速，2 h即可初步判断结果，若果血液中病毒量较低，结果可疑时，可于12 h后复测一次，逆转录聚合酶链式反应（RT
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PCR）技术快速检测病毒核酸，包括病人急性期血液等；2. 病毒特异性抗体检测：急性期病人早期特异性抗体IgM的测定；在新疆出血热病例的确诊和抗体动态的观察方面，间接ELISA的灵敏度最高，也可用免疫荧光法或RPHI测定；3. 毒株的鉴定和抗原性分析：可采用琼脂糖双相扩散沉淀试验、交叉抗体结合试验、交叉中和试验或交叉保护试验、免疫印迹试验等，及其他病毒特性的鉴定；4. 分子生物学技术：如病毒核酸的研究，SRNA或MRNA基因的扩增和序列的测定，进一步进行不同来源毒株的抗原性分析和遗传系统发生学的分析等。
[0008]XHF的诊断标准为主要依靠流行病学资料，包括流行地区、流行季节有放牧或野外工作史，有与羊、兔、牛等或急性期病人接触史、蜱虫叮咬史等。临床表现有急骤起病、寒战、高热、头痛、腰痛、口渴、呕吐、粘膜和皮肤有出血点，病程中有明显出血现象和/或低压休克等。实验室检查白细胞和血小板数均减少，分类中淋巴细胞增多，有异常淋巴细胞出现。补体结合试验，中和试验等双份血清抗体效价递增4倍以上者可以确诊。本病应与流行性出血热鉴别，流行性出血热有一定流行地区，临床上有明显的肾脏损害和五期经过，血清学试验可以区别。
[0009]XHF的治疗方法是根据病人的病理生理变化采用综合疗法，早期诊断、早期治疗可减轻病情发展。发热早期病人给予静脉输液，补充足量液体和电解质，并应用肾上腺皮质激素有一定疗效。近年来应用被感染的羊血清制备成冻干治疗血清，早期治疗获得良好的效果。用法：皮肤过敏试验阴性者，应用治疗血清10~15 ml，一次肌肉注射。病毒唑因对本病毒有明显的抑制作用，早期治疗可能由一定的效果。重型病人出现休克、腔道出血、肺水肿等，可参照流行性出血热治疗。
[0010]XHF的预防主要是切断传播途径，如防蜱叮咬，进入疫区的人员要加强防护等。我国研制的灭活乳鼠脑疫苗有预防效果。
[0011]我国已研制成功XHF的疫苗，系采用感染乳鼠脑组织后精制而成，在牧区试用的初步结果表明安全有效。
[0012]近年来，分子生物学方法不断被应用到血液类病原体的快速检测中，血液类病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了血液类病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。
[0013]其中，核酸等温扩增技术具有检测灵敏度高、结果判断直观，且不需要荧光定量PCR仪等价格昂贵的设备等优点，具有广泛应用前景。
[0014]环介导等温扩增技术（Loop
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mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型等温核酸扩增技术，具有快速、简便、经济、灵敏等优点，目前已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计3对引物（F3、B3、FIP[F1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新疆出血热病毒（Xinjiang hemorrhagic fever virus, XHFV）的环介导等温扩增技术（Loop
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Mediated Isothermal Amplification, LAMP）检测靶点：用于对新疆出血热病毒进行快速检测的专用引物，即根据新疆出血热病毒基因组的特异性保守靶序列设计，用以定性检测待测样品中的新疆出血热病毒；每套引物包含6条寡核苷酸序列，即2条外引物（F3、B3），2条内引物（FIP、BIP）和2条环引物（LF、LB）。2.一种新疆出血热病毒的LAMP检测方法，主要包括以下步骤：以待测物的基因组核酸为模板，在权利要求1所述专用引物的引导下进行LAMP扩增；扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，荧光信号可由仪器捕获，并进行处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟大利，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：