一种检测甲型流感病毒的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒（Influenza A virus,FluA）检测试剂盒，包括特异性扩增引物、测序引物、对照品、扩增试剂和扩增程序方法。本发明专利技术在检测甲型流感病毒方面有较高的准确性，同时可以对甲型流感病毒的具体亚型进行区分、确认，适合在临床甲型流感病毒检测中应用。

A kit for detecting influenza A virus

【技术实现步骤摘要】
一种检测甲型流感病毒的试剂盒
本专利技术涉及医学和生物技术，具体涉及一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒。
技术介绍
流感病毒是有包膜的单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），包括人流感病毒和动物流感病毒。根据核衣壳蛋白（NP）和基质蛋白（MP）不同，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。甲型流感病毒（InfluenzaAvirus,FluA）颗粒呈球状，表面有突起的糖蛋白，分别是血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质蛋白M，共有16种不同的血凝素H1～H16和9种不同的神经氨酸酶N1～N9。根据其表面的HA和NA的抗原性特点，将甲型流感病毒进一步分为许多亚型。由于甲型流感病毒抗原性易发生变异，容易形成新的亚型，引起世界性大流行。20世纪，人类共发生了4次流感大流行：1918年的西班牙流感（H1N1）、1957年的亚洲流感（H2N2）、1968年的香港流感（H3N2）和1977年的俄国流感（H1N1），这4次流感都给人类带来灾难性的后果。2009年出现了H1N1猪源流感病毒
(SOIV)，造成了二十一世纪第一次人类流感普遍流行，到2010年4月，仅美国就有43百万到89百万人感染此病毒。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8，其中H1、H5、H7是高致病性亚型。流感病毒的流行病学特征为：人群普遍易感，潜伏期长短取决于侵入的病毒量和机体的免疫状态，一般为1～4天。起病后患者有畏寒、头痛、发热、浑身酸痛、乏力、鼻塞、流涕、咽痛及咳嗽等症状。在症状出现的1～2天内，随分泌物排出的病毒量较多，以后则迅速减少。无并发症患者发病后第3～4天就开始恢复；如有并发症，则恢复期延长。流感的特点是发病率高，病死率低，死亡通常由并发细菌性感染所致。常见的细菌有肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等。并发症多见于婴幼儿、老人和慢性病（心血管疾病、慢性气管炎和糖尿病等）患者。目前流感病毒的临床或实验室诊断方法，主要包括病毒分离培养、血清学诊断和快速诊断方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种相对准确的检测甲型流感病毒核酸的试剂盒，用二轮PCR扩增程序的方法，解决一般测序方法灵敏度低的不足，适合在临床甲型流感病毒检测中应用。本专利技术的技术方案如下：一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒，包括特异性扩增引物对、测序引物对、对照品、扩增试剂和扩增程序方法。所述的特异性扩增引物对是指针对甲型流感病毒特征片段SEQIDNO:1进行扩增的引物对，包含具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示序列的引物对。所述的测序引物对用于测定甲型流感病毒特征片段SEQIDNO:1的碱基序列，其包含具有SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列的引物对。本专利技术的特异性扩增引物对和测序引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本专利技术的引物不限于上述的2对引物。本专利技术的试剂盒还包括对照品、扩增试剂和扩增程序方法。试剂盒的每一人份用法配方包括：6μLPCR缓冲液、1.2μL酶混合液、2μL特异性扩增引物。本专利技术的试剂盒中包含的试剂所适用的样品份数可以为一人份、二人份、四人份、八人份、更多人份等等，本专利技术不对此进行限定，本领域技术人员可根据需求自行选择和设置。本专利技术提供的检测方法，包含以下步骤：（1）核酸提取：使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（通用型））对待测样本进行核酸提取。（2）扩增反应：以上述提取的待测物核酸为模板，在特异性扩增引物的介导下进行扩增。每一人份用法配方为：6μLPCR缓冲液、1.2μL酶混合液、2μL特异性扩增引物。（3）一代测序反应，获得测序结果。（4）结果分析：在NCBI上进行比对、分析，确认病原体具体型别。本专利技术的有益效果如下：（1）本专利技术提供了一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒，有较高的准确性。（2）用二轮PCR扩增的方法，高于一般测序方法的灵敏度。（3）完成一次测序反应进行结果分析后，可直接对甲型流感病毒亚型进行鉴定、区分。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应该理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限定本专利技术的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本专利技术做出的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。下列实施例中试剂盒的常规组分均为市售获得。实施例1用于特异性扩增甲型流感病毒特征片段SEQIDNO:1的引物设计利用NCBI数据库，搜索不同亚型的甲型流感病毒特征片段，并进行序列保守性分析比对，针对各亚型均较保守的序列区段进行引物设计。引物设计一般采用Primerpremier5.0软件，按照引物设计的一般原则等参数要求进行设计分析，从得到的结果中选择二级结构较少的引物作为试剂盒的特异性扩增引物。引物设计的一般原则包括：长度17~25bp；GC含量30%~80%；退火温度（Tm值）为50~60℃；避免产生稳定的引物二聚体及发夹结构。实施例2甲型流感病毒检测试剂盒的制备（1）扩增试剂包括PCR缓冲液，含有60mMTris·HCl(pH8.8)、30mMKCl、30mMMgSO4、3MBetaine、4.5mMdNTPeach；酶混合液，包含逆转录酶3U/ul、TaqDNA聚合酶1U/ul。（2）引物含有一对甲型流感病毒扩增上下游引物（SEQIDNO:2和3）、一对甲型流感病毒测序上下游引物（SEQIDNO:4和5）。（3）阴阳性对照阳性对照有1个，为甲型流感病毒阳性的拭子样本，浓度为3.0E+05copies/mL；阴性对照有1个，为甲型流感病毒阴性的拭子样本。实施例3用本专利技术的试剂盒检测并鉴定购买的ATCC甲型流感病毒标准菌株（H1N1，ATCCVR1736）本专利技术的试剂盒在-20℃温度下保存。（1）甲型流感病毒基因组核酸提取使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（通用型））对待测样本进行核酸提取。（2）扩增反应以上述提取的待测物核酸为模板，在特异性扩增引物的介导下进行扩增。每一人份用法配方为：6μLPCR缓冲液、1.2μL酶混合液、2μL特异性扩增引物、5μL核酸提取液。将上述反应混合液的反应管置于普通PCR仪上，按以下两轮PCR方法进行扩增：（1）第一轮PCR扩增条件为：50℃反应25分钟，循环1次；95℃5分钟，循环1次；95℃45秒→56本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括特异性扩增引物对、测序引物对、对照品、扩增试剂和扩增程序方法；所述的特异性扩增引物对是针对甲型流感病毒特征片段SEQ ID NO:1进行扩增的引物对，具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列；所述的测序引物对用于测定甲型流感病毒特征片段SEQ ID NO:1的碱基序列，具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于Sanger一代测序技术的甲型流感病毒检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括特异性扩增引物对、测序引物对、对照品、扩增试剂和扩增程序方法；所述的特异性扩增引物对是针对甲型流感病毒特征片段SEQIDNO:1进行扩增的引物对，具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3序列；所述的测序引物对用于测定甲型流感病毒特征片段SEQIDNO:1的碱基序列，具有SEQIDNO:4和SEQIDNO:5序列。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增试剂包括PCR缓冲液、酶混合液和特异性扩增引物。


3....

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽娟，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31