一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒制造技术

本发明专利技术属于病原微生物检测技术领域，涉及一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒。本发明专利技术提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LSDV检测正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的LSDV检测反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LSDV检测探针；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3

【技术实现步骤摘要】
一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒


[0001]本专利技术属于病原微生物检测
，具体涉及一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒。

技术介绍

[0002]牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，又称牛结节疹、牛疙瘩皮肤病，是由牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)引起的一种牛急性、亚急性或慢性传染病，以发烧、浅表淋巴结肿大和皮肤或粘膜上形成多个结节为主要病症。该病可对病畜皮肤造成永久性伤害，通常还会导致产奶量下降，生长发育迟缓，公畜不育以及孕畜流产等症状，对经济生产具有重要的影响。
[0003]LSDV与绵羊痘病毒(Sheeppox virus，SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)同属于羊痘病毒属(Capripoxvirus，CAPV)，三者基因组同源性可达97％左右。因此，目前有许多国家使用羊痘疫苗对LSDV进行防控。LSDV主要通过蜱、蝇、蚊等昆虫传播，也可以通过唾液和精液等分泌物传播。目前，我国广泛采用山羊痘弱毒疫苗免疫羊来预防山羊痘和绵羊痘，采用5倍剂量山羊痘弱毒疫苗免疫牛来预防牛结节性皮肤病。但弱毒疫苗的广泛使用存在排毒污染环境的潜在风险，同时动物免疫后短期内可能出现注射部位肿胀、体表浅表结节及发热等局部或全身性反应。因此，实现LSDV病毒快速准确的诊断，对于区分流行毒株感染和弱毒疫苗免疫，从而制定防控策略具有重要指导意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组和试剂盒。本专利技术的引物探针组具有较高的敏感性和特异性，能够实现牛结节性皮肤病病毒的高效检测。
[0005]本专利技术提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LSDV检测正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的LSDV检测反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LSDV检测探针；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有猝灭基团。
[0006]优选的是，所述荧光基团包括羧基荧光素；所述猝灭基团包括MGB。
[0007]本专利技术还提供了上述技术方案所述引物探针组在制备用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测产品中的应用。
[0008]本专利技术还提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括含上述技术方案所述引物探针组的48
×
反应管溶液。
[0009]优选的是，所述试剂盒还包括qPCR Enzyme、阳性对照和阴性对照。
[0010]本专利技术还提供了利用上述技术方案所述引物探针组或上述技术方案所述试剂盒的非疾病诊断目的地检测牛结节性皮肤病病毒的Taqman
‑
MGB荧光定量PCR方法，包括如下
步骤：配制反应体系；利用上述技术方案所述引物探针组进行荧光定量PCR反应；判定试验是否成立；结果判定。
[0011]优选的是，每25μL的反应体系包括17.5μL的液体48
×
反应管溶液、2.5μL的qPCR Enzyme、5μL的样品或阳性对照或阴性对照。
[0012]优选的是，所述荧光定量PCR反应的反应条件为：第一阶段：95℃3分钟；第二阶段：95℃15秒、60℃30秒，共45个扩增循环。
[0013]优选的是，判定试验是否成立的标准包括：阳性对照Ct值≤35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，则判为试验成立。
[0014]优选的是，所述结果判定包括：待检样品Ct值≤35并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品35＜Ct值≤40判定为疑似；待检样品无Ct值并且无扩增曲线，判为阴性；对于判定为疑似的样品进行复检，若Ct值≤40，则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0015]本专利技术提供了一种用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组。利用本专利技术所述引物探针组对牛结节性皮肤病病毒进行荧光定量PCR检测，具有以下有益效果：
[0016](1)灵敏度高：LSDV核酸的最低检出限可达5copies/μL。
[0017](2)特异性好：特异性针对LSDV基因组，产生相应的荧光扩增信号。经验证，对山羊痘病毒(GTPV)、牛疱疹病毒I型(BHV
‑Ⅰ
)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等相关反刍动物疫病病原微生物和健康动物的血液、唾液、皮肤样品，无交叉反应。
[0018](3)快速高通量：检测速度快，加入样品后1h左右即可完成整个扩增检测过程，且根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现96～384个样品的同步检测。
[0019](4)操作简便：配置好的Taqman
‑
MGB荧光定量PCR反应体系，直接加入待检DNA。于荧光定量PCR仪中，即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为本专利技术提供的引物筛选结果图；
[0022]图2为本专利技术提供的扩增LSDV GPCR(ORF011)基因部分序列的引物和探针示意图；
[0023]图3为本专利技术提供的阳性质粒制备电泳结果图；其中，M：2000 DNA Marker；1：pGEM
‑
T Easy空载体对照；2：重组质粒扩增结果；
[0024]图4为本专利技术提供的荧光定量PCR阳性对照质粒标准曲线结果图；
[0025]图5为本专利技术提供的荧光定量PCR灵敏度试验结果图；
[0026]图6为本专利技术提供的荧光定量PCR特异性试验结果图；
[0027]图7为本专利技术提供的试剂盒批内重复性试验结果图；
[0028]图8为本专利技术提供的试剂盒批间重复性试验结果图；
[0029]图9为本专利技术提供的临床样品检测结果图。
具体实施方式
[0030]本专利技术提供了用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LSDV检测正向引物(F1)：CCAAACCACCATACTAAGTACAATTCCA、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的LSDV检测反向引物(R5)：ACCTAGCTGTAGTTCACCCAGT，和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LSDV检测探针(P2)：TCAATGCCGATAAGGA；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有猝灭基团。在本专利技术中，所述荧光基团优选包括羧基荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的引物探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的LSDV检测正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的LSDV检测反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的LSDV检测探针；所述探针的5'端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有猝灭基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括羧基荧光素；所述猝灭基团包括MGB。3.权利要求1或2所述引物探针组在制备用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测产品中的应用。4.用于牛结节性皮肤病病毒的荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含权利要求1或2所述引物探针组的48
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反应管溶液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括qPCR Enzyme、阳性对照和阴性对照。6.利用权利要求1或2所述引物探针组或权利要求4或5所述试剂盒的非疾病诊断目的地检测牛结节性皮肤病病毒的Taqman
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【专利技术属性】
技术研发人员：彭辰，许冠龙，谢士杰，吴文学，崔连新，王爽，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：