检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒及检测方法。该试剂盒，包括反转录体系、第一轮扩增体系、第二轮扩增体系、阳性质控品和阴性质控品，所述第一轮扩增体系包括引物库，所述引物库中的引物的Tm值保持为60

【技术实现步骤摘要】
检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]病原微生物检测是感染诊断的难题，不同微生物引起的感染症状往往非常相似，难以分辨。对于大部分病原体来说，培养是微生物检测的金标准，而分离培养耗时长、灵敏度有限，还有部分微生物对培养方法要求很高，甚至无法进行培养，这就出现了诊断困难的现状。传统的免疫学手段和分子生物学方法只能检测出单一或者几种常见病原体，这种局限性体现在往往依赖于临床医生对病人感染病原体的预判，这种经验的预判存在一定误诊的风险。
[0003]近年来，宏基因组(meta
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genomic next
‑
generation sequencing，mNGS)检测的发展，可以对样本中病原体进行无偏好性检测，无需预判，一次性检出样本中存在的所有细菌、真菌、病毒、寄生虫和其他特殊病原体，特别适合临床危急重症感染检测。如公告号为CN113337639B的中国专利技术专利，公开了种基于mNGS的检测COVID
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19新型冠状病毒的方法及其应用，该方法中通过设计制备COVID
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19新型冠状病毒的多重基因组特异性逆转录引物组，提高了新冠病毒RNA的逆转录效率，降低气溶胶污染问题，同时还提高了对不同变异病毒核酸序列的富集能力。
[0004]然而，随着技术的发展，宏基因组的局限性逐渐显现出来：
①
由于mNGS的人源宿主占比极高，微生物含量低的生物样本特性，导致了真实可用的测序数据往往不足10％，甚至大部分样本不足1％，造成了灵敏度较低的技术特性，同时也容易带出大量的背景微生物，干扰判读结果；
②
mNGS产品检测成本高，对实验技术人员要求也高，导致了检测价格居高不下，单次3000～5000元的检测费用，造成了产品受众少，甚至成为了仅面对危重症患者的产品；
③
流程复杂，出错风险高；检测周期长，检测结果反馈慢；
④
低灵敏度导致对病原体信息捕捉具碎片化、随机化的特点，无法获取稳定的可信的监测信息，无法监测耐药基因、毒力因子以及病毒突变，也无法对同源性高的病原体进行区分和分型，是经典宏基因组检测的重要局限性。
⑤
mNGS产品受到技术限制，DNA和RNA流程很难合并检测，分流程检测导致了成本的增加，也增加了患者的检测负担。
[0005]靶向捕获测序(Targeted capture sequencing，tNGS)可以兼顾mNGS技术，具有对临床多种病原的无偏好快速检测的特点，同时可以根据疾病特点设计对应的常见病原检测清单，降低检测成本，提高检测灵敏度，同时可以对病原进行种水平基因分型，也可以检测耐药基因。tNGS技术可作为临床mNGS产品的补充，用于临床未知病原的检测，也可用于用药预后监控。
[0006]靶向捕获测序常见技术路线有两种，一种是探针捕获，一种超多重PCR。探针捕获法可以检测覆盖的病原及基因突变类型更多，病原基因覆盖度会更好，但杂交捕获时间长，步骤繁琐，成本高。多重PCR方法操作简单，时间短，灵敏度高，对仪器设备的要求也简单，非
常适合临床病原检测的需求。然而多重PCR产品开发的难点在于(1)如何针对广泛的病原体设计特异性的扩增引物，既能够区分不同属或种的病原，又能尽可能的覆盖种间型别差异；(2)如何尽可能降低同一PCR反应管中的几百、几千或几万条引物之间形成二聚体、发卡结构等异常结构；(3)如何调整引物间的扩增效率差异，使各引物间的扩增效率尽量均一；(4)如何灵活的根据需要去调整panel中引物组合，已适应产品性能的优化。

技术实现思路

[0007]为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒及检测方法，该方法覆盖广、时效性快、灵敏度高、特异度强，该方法以非诊断为目的。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒，包括反转录体系、第一轮扩增体系、第二轮扩增体系、阳性质控品和阴性质控品，所述第一轮扩增体系包括引物库，所述引物库中的引物的Tm值保持为60
±
5℃，扩增子长度为100～200bp，引物长度为15～25，GC含量为40～65％，所述引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰。
[0009]本专利技术的另一技术方案为：检测常见病原微生物及耐药基因的检测方法，包括以下步骤：
[0010]S1：对待测样本进行核DNA/RNA核酸共提取；
[0011]S2：反转录；
[0012]S2：使用上述的试剂盒依次进行多重靶向PCR扩增，片段分选、加接头扩增和再次纯化得到文库；
[0013]S3：文库质检后上机进行测序与数据分析，输出数据质控结果和病原检出结果。
[0014]本专利技术的有益效果在于：本专利技术开发了一种基于超多重PCR技术和高通量测序技术对临床常见218种病原微生物及15耐药基因的快速富集检测方法和检测试剂盒。该试剂盒覆盖的218种病原体，包括98种细菌，26种真菌、18种DNA病毒和35种RNA病毒，以及16种特殊病原体。还覆盖了临床常见的15个重要耐药基因的检测。在满足病原体检测的同时，同时对耐药基因进行分型检测。该方法可适用于呼吸道感染、血流感染、中枢神经感染等常见的临床病原微生物及耐药基因的检测。
[0015]针对病原微生物包括细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒等多重类型的特点，针对不同来源样本类型(肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液等)，不同类型病原体(细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒等)，本专利技术开发了DNA和RNA共提取的方法，通过一次核酸提取，能够同时富集样本中DNA和RNA；一次检测可同时覆盖DNA和RNA层面的病原检测，用最少样本、最低成本、最大程度检出样本中的疑似病原。
[0016]本专利技术提供的试剂盒用于检测时，涉及的多重PCR方法操作简单，时间短，灵敏度高，对仪器设备的要求也简单，非常适合临床病原检测的需求。
[0017]然而多重PCR产品开发的难点在于(1)如何针对广泛的病原体设计特异性的扩增引物，既能够区分不同属或种的病原，又能尽可能的覆盖种间型别差异；(2)如何尽可能降低同一PCR反应管中的几百、几千或几万条引物之间形成二聚体、发卡结构等异常结构；(3)如何调整引物间的扩增效率差异，使各引物间的扩增效率尽量均一；(4)如何灵活的根据需
要去调整panel中引物组合，已适应产品性能的优化。
[0018]针对上述难点，本专利技术对引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰，避免引物之间形成二聚体；引物的Tm值保持均一(60℃
±
5℃)，扩增子长度在,100～200本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒，其特征在于，包括反转录体系、第一轮扩增体系、第二轮扩增体系、阳性质控品和阴性质控品，所述第一轮扩增体系包括引物库，所述引物库中的引物的Tm值保持为60
±
5℃，扩增子长度为100～200bp，引物长度为15～25，GC含量为40～65％，所述引物的3
’
末端进行RNA碱基修饰和3
’
末端Spacer C3修饰。2.根据权利要求1所述的检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述引物库的二聚体含量＜10％。3.根据权利要求1所述的检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述反转录体系包括反转录缓冲液、反转录酶、随机引物六聚体和核酸模板。4.根据权利要求3所述的检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述反转录缓冲液、反转录酶、随机引物六聚体和核酸模板的体积比为5:0.5:0.5:1:3。5.根据权利要求1所述的检测常见病原微生物及耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述第一轮扩增体系还包括多重PCR扩增预混液、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张盼，郭文浒，刘华勇，陈浩，杨洁，刘斌，
申请(专利权)人：福州奥吉芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：