一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种登革病毒通用型RT‑RAA‑LFD扩增引物及检测方法。本发明专利技术针对1～4型登革病毒的3'端非翻译区共同保守区域，设计了一对使用于RAA技术的特异性引物，正、反向引物的5'端分别用6‑羧基荧光素和生物素进行标记，这使得阳性的双链扩增产物的两端分别被标记上FAM和生物素。再利用包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸，通过免疫层析法对扩增结果进行肉眼可视的判读，摆脱了对荧光定量仪器的依赖，最低检测浓度为10个拷贝/μL，与黄病毒科的其他病毒无交叉反应。将该扩增引物和方法用于临床样本，可成功检测出登革病毒RNA，与荧光定量PCR检测结果的一致性达到96％。

Rt-raa-lfd amplification primer and detection method for dengue virus

【技术实现步骤摘要】
一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及检测方法。
技术介绍
登革热是当今全球范围内传播速度最快的虫媒传染病，它由1～4型登革病毒(Denguevirus,DENV)经伊蚊叮咬传播引起。在广东省地处亚热带，气候适宜蚊虫孳生，人口密度大，是我国登革热发病和传播的高发地区。2001年至2014年，我国大陆地区共报告56896例登革热，而仅仅广州市就发生了42530例，占全国发病人数的74.8％。疾病不仅给患者造成生理上的疼痛和心理上的压力，同时也给政府和个人带来了较高的经济负担。目前临床使用的荧光定量PCR方法灵敏度高，但必须依赖精密控制温度的仪器，同时对实验环境、操作者的专业知识和技能都有较高的要求，在基层医院和社区门诊等处难以开展，使患者错过早发现早治疗的最佳时期，也不利于及时切断和隔离传染源。重组酶辅助扩增(RAA)是一种利用UvsX、UvsY、SSB和聚合酶四种酶的新等温核酸扩增技术。寡核苷酸引物与UvsY，UvsX酶形成复合体，识别双链DNA中的同源序列，使双链DNA解链成单链。然后SSB与游离的单链结合，DNA聚合酶与UvsY，UvsX酶引物复合体结合后启动核酸扩增。RAA反应在35-45℃的条件下即可进行快速且特异的扩增。到目前为止，RAA可检测不同种类的细菌和病毒，已广泛应用于传染病诊断和食品污染测试。本专利技术旨在设计一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及相应的检测方法。>
技术实现思路
本专利技术的目的在于设计一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及相应的检测方法。本专利技术通过RT-RAA核酸扩增技术实现核酸分子在常温下的快速扩增，利用FAM-抗FAM特异性抗体、链霉亲和素-生物素系统对扩增片段标记和特异识别，应用免疫层析法LFD对扩增产物进行可视化检测，建立一种易操作、耗时短的DENV核酸POCT(point-of-caretesting)检测技术，及时监测新发感染和预警重症病例，使传染源及早被切断，患者得到及时的治疗，最终降低感染的传播率与疾病死亡率。本专利技术通过以下技术方案来实现：一组基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒通用型扩增引物，为如下所示：RAA-F：5'-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；RAA-R：5'-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。所述的正、反向引物的5'端分别用6-羧基荧光素(FAM)和生物素进行标记。即引物对为如下：RAA-F：5'-FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；RAA-R：5'-biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。一种基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒检测试剂盒，其包含上述的登革病毒通用型扩增引物对RAA-F/RAA-R和包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸(Lateralflowdipstick,LFD)。优选，所述的登革病毒检测试剂盒，还含有RAA反应缓冲液、去核酸酶水、冻干酶粉、醋酸镁。一种基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒检测方法，包括以下步骤：(1)以上述的引物对RAA-F/RAA-R作为扩增的上下游引物，将25μLRAA反应缓冲液、1.25μMRAA-F和1.25μMRAA-R各2μL、1μL模板、17.5μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200μLEP管中，最后加入2.5μL280mM醋酸镁，在37℃恒温条件下反应20分钟，获得扩增产物；(2)取5μL扩增产物加入100μL的样品缓冲液中，充分混匀后取60μL加至包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸条加样区，3分钟即可读取结果，质控线与检测线同时呈红色为阳性结果，只有质控线呈红色为阴性结果，质控线不显色提示实验失败。本专利技术上述的登革病毒通用型扩增引物RAA-F/RAA-R或包含该扩增引物RAA-F/RAA-R的登革病毒检测试剂盒可用于制备检测登革病毒的相关产品，用于测定登革病毒。与现有技术相比，本专利技术的优势在于：(1)本专利技术公开了一组基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的通用型DENV核酸扩增引物和扩增方法，在不需要特殊仪器的情况下，30分钟内即可实现DENV核酸的POCT(point-of-caretesting)扩增与检测。本专利技术根据NCBI数据库中登革病毒全基因组的多重比对结果，选择高度保守的3'端非翻译区作为检测靶区，设计了特异性扩增引物。正、反向引物的5'端分别用6-羧基荧光素(FAM)和生物素进行标记，这使得阳性的双链扩增产物的两端分别被标记上FAM和生物素。再利用包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸(Lateralflowdipstick,LFD)，通过免疫层析法对扩增结果进行肉眼可视的判读，摆脱了对荧光定量仪器的依赖。该方法可检测的最低浓度为10copies/μL，对乙脑病毒、寨卡病毒、基孔肯雅热病毒均无非特异性扩增。将该扩增方法应用于临床样本，在37℃恒温条件下扩增20分钟即可成功检测出血清中的登革病毒RNA，与荧光定量PCR检测结果的一致性达到96％。(2)与现有的荧光定量PCR，及其他使用到荧光探针的检测方法比较，本方法易操作、耗时短，不需要装备精良的实验室和精密仪器，特别是不需要荧光检测仪的特殊仪器，可在基层医院、社区、甚至家庭进行第一时间筛查，助于疫情的监测和早期发现，以避免患者错过治疗的最佳期，最终降低感染的传播率与疾病死亡率，具有广阔的应用前景。附图说明图1为登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物的反应温度的优化。图2为登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物的反应时间的优化。图3为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增的引物浓度优化图4为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD侧向流检测的反应时间优化。图5为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增用引物的灵敏度分析。图6为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增用引物的特异度分析。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。下述实施例中的RAA反应缓冲液、去核酸酶水、含有冻干酶粉的EP管、醋酸镁均取自RAA检测试剂盒，该试剂盒购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号B00000。实施例1：登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增策略及引物设计登革病毒是单正链RNA病毒，全基因组大小约11kb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其5'端为I型帽子结构，3'端缺乏poly(A)尾，基因组的5'端和3'端均有一段非编码区。RAA技术要求上下游引物长度大于30bp。在以上限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒通用型扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物如下所示：/nRAA-F：5'-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；/nRAA-R：5'-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。/n

【技术特征摘要】
1.一组基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒通用型扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物如下所示：
RAA-F：5'-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；
RAA-R：5'-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。


2.根据权利要求1所述的登革病毒通用型扩增引物，其特征在于，所述的正、反向引物的5'端分别用6-羧基荧光素和生物素进行标记。


3.一种基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的登革病毒通用型扩增引物和包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸。


4.根据权利要求3所述的登革病毒检测试剂盒，其特征在于，还含有RAA反应缓冲液、去核酸酶水、冻干酶粉、醋酸镁。

【专利技术属性】
技术研发人员：穆小萍，罗娅莎，熊玉锋，赖科峰，叶青，郑淑华，郭军飞，
申请(专利权)人：广东省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：广东;44