肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆及其应用制造技术

肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆及其应用。以ＰＧＥＭ－３ｚｆ（＋）质粒为载体，用内切酶切开该环状质粒。将直接以病人血清作为分析样品，以扩增片段为３９０Ｂｐ－４３０Ｂｐ的ＰＣＲ产物用酶补平其末端，用连接酶把它连接到已酶切的质粒上成为环状的重组质粒，重组质粒可作为出血热病毒基因检测盒中的阳性参照物，用以对出血热病人的确诊。基因检测法灵敏高，特异性强，该阳性参照物易于保存，用于电泳鉴定，易于判断，且可用于试剂盒的质量及操作正确与否的检验。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆及应用，涉及基因工程生物技术，特别涉及分子生物学中的病毒基因克隆技术。肾综合征出血热(HFRS)是由肯尼亚病毒汉坦病毒属(HantaVirus)中某些病毒引起的人类急性传染病。近年来迅猛发展的基因检测法(PCR法)是从核酸水平上检测病毒。此法灵敏度高，特异性强，能在早期的临床标本中直接检测病原体，如肺炎杆菌、结核杆菌、幽门螺杆菌、各型肝炎病等，其基因诊断试剂盒已进入了临床实验室。然而迄今为止，尚未有以病人血清为标本，用PCR法直接检测肾综合征出血热病毒的技术。由上海市南汇县南华医院即我院申请的申请号为96116395.x、专利技术名称为肾综合征出血热病毒的基因检测方法及检测试剂盒的专利技术专利所提供的方法是直接以病人血清为分析样品，提取出血热病毒的RNA，经过逆转录(RT)、CDNA的合成，PCR扩增，然后对PCR的扩增产物进行电泳鉴定，如果标本扩增带与阳性参照物扩增带同一位置上出现光带，则可判定标本为阳性，显示出血液中存在出血热病毒，反之则无。该专利技术专利中所提供的检测试剂盒中的阳性参照物是采用(1)已确诊患有出血热病的病人血清，(2)市售的PCR marker。用病人血清作为阳性参照物，存在着如下问题1、来源较困难，固出血热病毒血症期短，不易得到早期标本；2、病人血清，不易较长时间保存；3、采用病人血清经PCR扩增后，电泳鉴定时可能会出现杂带而给结果的判断带来困难。而用市售PCR marker作为阳性参照物价格又很昂贵。出血热病毒的克隆当然是很好的阳性参照物，然而迄今为止尚无有此种技术。本专利技术的目的在于提供一种肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆，它是采用由我院申请的申请号为96116395.x专利技术专利所提供的方法，对所获得的汉坦病毒基因的PCR扩增产物进行克隆，这种克隆可放在肾综合征出血热病毒的检测试剂盒中作为检测的阳性参照物。本专利技术的目的通过如下技术实现。克隆是选择一种质粒为载体，用内切酶切开环状的质粒载体，所需插入于被切开的质粒的插入物用酶补平其末端，再用连接酶把经酶切的质粒载体和插入物重新连接成环状得到重组质粒，再把它转化到宿主菌，通过细菌培养获得大量的重组质粒，可用于PCR阳性对照。本专利技术的技术特征在于，连接到已酶切的质粒载体中的连接物(或称插入物)即PCR产物是直接以病人血清为分析样品，以异硫氰酸胍为裂解液、醋酸钠作为RNA沉淀剂，提取肾综合征出血热病毒的RNA，经过逆转录、合成CDNA，做第一次PCR扩增，再做巢式PCR，进行第二次扩增，然后以电泳检测后(可以PCR marker对照)，确定为具有出血热病毒基因的扩增片断在390Bp-430Bp的PCR扩增产物。做第一次PCR扩增的扩增引物采用核苷酸位置 引物序列primer1 30-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2 648-631 AAT ATC AAA GAT CCC ATG第一次PCR扩增需在扩增仪中循环35次，扩增片段为618Bp，将第一次PCR扩增产物做巢成PCR。进行第二次PCR扩增，第二次PCR扩增的扩增引物是核苷酸位置 引物序列primer130-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer3 460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT取得扩增片段为430Bp的PCR产物。在做第二次PCR扩增时，扩增引物也可以核苷酸位置 引物序列primer4 70-89GCC AGT TTA GTA TGG GCTprimer3 460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT组成一对引物，则得到扩增片段为390Bp的PCR产物。克隆时选用双链环状的PGEM-3zf(+)质粒作为载体，用内切酶smaI切开环状载体，直接从肾综合征出血热病人血清中获得的汉坦病毒的PCR产物用klenow修饰酶补平其末端，再用T4DNA连接酶把已酶切的载体和根据上述方法制备的PCR产物重新连接成环状，得到重组质粒，将它转化至宿主菌，宿主菌采用大肠杆菌JM109感受态细胞，通过细菌培养获得大量重组质粒。所述的大量重组质粒是否确已获得可通过以未克隆的PGEM-3zf(+)质粒为对照走琼脂糖电泳来鉴定。该大量重组质粒即可用作为肾综合征出血热汉坦病毒检测试剂盒的阳性参照物，将它与应用申请号为96116395.x所提供的PCR方法获得PCR产物，共同走电泳，可用于出血热病的诊断。本专利技术的优点在于1、以经克隆的重组质粒作为阳性参照物易于保存，用于电泳鉴定时易于判断。2、克隆得到的重组质粒还可用来检验试剂盒的质量及操作是否正确。因为重组质粒克隆了汉坦病毒的基因扩增产物，它的电泳结果应该肯定呈阳性，如果呈阴性则可判定为试剂盒的试剂质量或操作有问题。下面提供详细的实施例以对本专利技术的技术方案作进一步说明。1、质粒载体酶切选用PGEM-3zf(+)质粒，用smaI酶切取PGEM-3zf(+) (2ug/ul)(ug为微克、ul为微升) 2ulSmaI (lou/ul) 1ulBufferI 2ul蒸馏水15ul共20ul混和液在25℃温度下保温1小时后置70℃保温10分钟以灭活SmaI。取出4ul上述混和液走琼脂糖电泳，以未切过的PGEM-3zf(+)质粒为对照，判断是否酶切完全，然后于-20C保存。2、PCR产物处理采用由我院申请的申请号为96116395.x、专利技术专利所提供的方法，出血热汉坦病毒基因扩增产物即PCR产物用klenow酶补平其末端。取PCR产物40ul klenow(5u/ul)(u为单位)在37℃下保温30分钟，加4ul、3mol(摩尔)、PH为5.2的醋酸纳，再加入80ul无水乙醇，置于-70℃保温15分钟，以转速为10000rpm，离心15min(分钟)，用70％乙醇洗涤，经真空干燥，溶于5ul无菌水，于-20℃保存。3、连接取酶切过的PGEM-3zf(+)1ul处理过的PCR产物 5ulT4DNA连接酶(3u/ul) 2ul10×连接酶缓冲液 1ul无菌H2O 1ul共10ul混和液在22℃保温3hrs(小时)后于-20℃保存。4、转化应该说至上述步骤已完成了克隆过程，但为了验证PCR产物已克隆到了质粒载体，取得了重组质粒，需要将其转化到宿主菌，经细胞培养，以获得大量的重组质粒，再进行鉴定。把已连接了PCR产物的质粒载体转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。从-20℃取出JM10g感受态细胞，置于冰上5min至融化。取100ulJM109感受细胞至预冷的载菌玻璃试管。加入10ul已连接了PCR产物的质粒载体，轻轻敲打混匀后置于冰上10min，于42℃保温45-50sec(秒)，立即置于冰上2min，加入900ul∠B(培养液)，于37℃，225rpm振荡培养1hr，取100ul涂布于含100ug/ml氨苄青霉素、0.5MIPTG(指示剂)，40ug/ml×-gal的∠B平板，37℃培养过夜。5、鉴定挑出白色菌落进行酶切鉴定。已连接了PCR扩增片段的重组质粒是呈白色的菌落，而呈蓝色的菌落则是未连接PCR扩增片段的质粒。挑出白色菌落，接种于21ul含100ug/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
肾综合征出血热汉坦病毒基因扩增产物的克隆，选择一种质粒为克隆载体，用内切酶切开环状的质粒载体，需连接的ＰＣＲ产物用酶补平其末端，用连接酶把经酶切的质粒载体和需连接的ＰＣＲ产物重新连接成环状取得重组质粒，再把它转化到宿主菌，通过细菌培养获得大量的重组质粒，其特征在于连接到已酶切的质粒载体中的ＰＣＲ产物是直接用病人血清作为分析样品、经ＰＣＲ扩增后，鉴定为阳性病人的血清ＰＣＲ产物，是扩增片段为３９０Ｂｐ－４３０Ｂｐ的ＰＣＲ产物，它通过如下方法获得：直接以病人血清作为分析样品，以异硫氰酸胍为裂解液、醋酸纳作为ＲＮＡ沉淀剂，提取肾综合征出血热汉坦病毒的ＲＮＡ，经过逆转录、ＣＤＮＡ的合成，做第一次ＰＣＲ扩增，扩增引物是：核苷酸位置 引物序列ｐｒｉｍｅｒ１ ３０－４９ ＣＡＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＡｐｒｉｍｅｒ２ ６４８－６３１ ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＴＧ扩增片段约为６００ＢＰ，经循环扩增后，将第一次ＰＣＲ扩增产物做巢式ＰＣＲ，进行第二次ＰＣＲ扩增，第二次ＰＣＲ的扩增引物是：核苷酸位置 引物序列 ｐｒｉｍｅｒ１ ３０－４９ ＣＡＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＡｐｒｉｍｅｒ３ ４６０－４４３ ＧＧＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＴ经循环扩增，取得扩增片段约为４３０Ｂｐ的ＰＣＲ产物；做第二次ＰＣＲ扩增时 ，扩增引物采用下列一对引物：核苷酸位置 引物序列ｐｒｉｍｅｒ４ ７０－８９ ＧＣＣ ＡＧＴ ＴＴＡ ＧＴＡ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＴｐｒｉｍｅｒ３ ４６０－４４３ ＧＧＣ ＴＴＧ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＴ经循环扩增，则取得扩 增段为３９０Ｂｐ的ＰＣＲ产物。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：储峰，季青，严润民，王霞明，
申请(专利权)人：上海市南汇县南华医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]