本公开涉及经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或CD163基因的至少一个等位基因已经失活。SIGLEC1基因的两个等位基因和/或CD163基因的两个等位基因失活的经基因修饰的猪抗猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。还提供了产生此类转基因猪的方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请为2012年5月16日提交的，专利技术名称为"抗猪生殖与呼吸综合征病毒的动 物"的PCT申请PCT/US2012/038193的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为 2013 年 11 月 15 日，申请号为 201280023487. 4。 政府支持 本专利技术是在由农业部授予的合同号（USDA/ARS) 58-1940-8-868的政府支持下进 行。政府具有本专利技术的某些权利。 序列表 本申请含有2012年5月15日生成的标题为"UM0 11053.WOSEQ_ST25"的序列表， 其据此通过引用整体并入。
本专利技术通常涉及经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失 活和/或⑶163基因的至少一个等位基因已经失活。还提供了产生此类转基因猪的方法。 专利技术背景 猪生殖与呼吸综合征病毒是猪经济上最重要的疾病之一。1987年在美国 (Keffaber1989)和1990年在欧洲（Wensvoort等1991)首先检测到这种疾病。对原型 PRRS病毒（PRRSV)VR-2332和雷皇斯塔德（Lelystad)(分别为美国和欧洲分离株）的分子 分析已经表明，趋异进化菌株几乎同时出现在两个大洲，这可能是由于猪管理实践上的类 似变化（Murtaugh等1995 ;NelSen等1999)。自从其最初出现以来，这种病毒就在世界范围 内传播，并且在美国猪群中已经检测到欧洲基因型的PRRSV(Ropp等2004)。PRRS的特征在 于严重且有时致命的呼吸道疾病和生殖障碍，但是也使受感染猪易感染细菌性病原体以及 其它病毒病原体（Benfield等1992)，并且是经济显著的猪呼吸系统疾病综合征（PRDC)的 主要组成部分。急性感染期间PRRSV引起的最一致的病理损伤是间质性肺炎和轻度淋巴细 胞性脑炎（Plagemann1996)。在特征为病毒血症和临床疾病的PRRSV感染的急性期后，许 多猪完全恢复，然而在较长一段时间携带低水平病毒感染。这些"载体"猪受PRRSV持续感 染并且间歇或连续地传播病毒，并且可能在直接或间接接触后感染未实验的猪。在实验条 件下，受PRRSV持续感染也有良好的文档记录（Albina等1994 ;Allende等2000;Benfield 等 1998;Christopherhennings等 1995;Sur等 1996;Yoon等 1993)。最显著的是，已经在 感染157天后回收了传染性病毒（Wills等1997)。虽然也已经证实肺细胞和睾丸的上皮生 殖细胞受感染（Sur等1996 ;Sur等1997)，但是组织巨噬细胞和单核细胞是急性和持续感 染期间的主要靶细胞（Molitor等1997)。PRRS的病原是为巢状病毒母（orderNidovirales)动脉炎病毒科 (Arteriviridaefamily)成员的被膜的正链RNA病毒。动脉炎病毒科的其它成员包括小鼠 乳酸脱氢酶增高病毒（LDV)、马动脉炎病毒（EAV)和猿出血热病毒（SHFV)。对基因组序列 数据的分析显示PRRSV菌株间的广泛多样性，但是也显示出非常保守的结构域（Andreyev 等1997;Meng2000 ;Meng等1995)。PRRSV的基因组构成与其它动脉炎病毒的基因组构成 类似，对于ORFla复制酶蛋白而言基因组RNA起信使RNA作用（Plagemann1996)。ORFla和lb包含约80%的病毒基因组并且编码RNA依赖性RNA聚合酶以及加工成其它非结构蛋 白的多蛋白（Snijder和Meulenberg1998)。使用雷皇斯塔德病毒，已经确定0RF2-7编码 病毒结构蛋白。ORF5(GP5)和M编码的蛋白（VanBreedam等2010b)在PRRSV诱导凋亡 中起作用（Suarez等1996 ;Sur等1997)并且被认为是密切相关的乳酸脱氢酶增高病毒中 的病毒吸附蛋白。PRRSV的较小包膜糖蛋白GP2a和GP4与CD163相互作用（Das等2010)。 有数据表明，与SIGLECU唾液酸结合性Ig样凝集素1)结合是进入细胞所必需的，并且实 际上对于病毒感染而言似乎需要与SIGLEC1和⑶163双重结合（VanGorp等2008)。 PRRSV致病原因（特别是在分子水平上）和动物流行病学的许多特征知之甚少，因 此使得控制工作很困难。为了获得更好的理解，已经研发了PRRSV的传染性克隆（Nielsen 等2003)。现今生产商常常用改良-活减毒菌株或灭活病毒疫苗为猪接种PRRSV疫苗。然 而，由于菌株变异和免疫系统的刺激不足，当前的疫苗往往并未提供令人满意的保护。因 为已经证明，在用PRRSV的同源菌株激发猪时先前接触可提供完全保护，所以保护性免疫 反应是可能的（Lager等1999)。然而，从未对用异源菌株激发一致性证明保护性免疫。除 担心可用PRRSV疫苗的功效外，有强有力的证据表明，如在实验感染猪后用毒性野外分离 株所证明的那样（Rowland等1999)，目前使用的改良-活疫苗可继续存在于个别猪和猪群 中并积累突变（Mengeling等1999)。此外，已经证实疫苗病毒是在接种公猪的精液中传播 (Christopherhennings等1997)。作为接种疫苗的替代方案，一些专家正提倡生殖群中的 "试验和去除"策略（Dee和Molitor1998)。这种策略的成功使用取决于去除受PRRSV急性 或持续感染的所有猪，接着严格控制以防再引入病毒。与这种策略相关的困难和大部分费 用是，对持续性PRRSV感染的致病原因知之甚少，因此没有可靠技术鉴定受持续感染的猪。 已经用单克隆抗体鉴定了PRRSV的假定细胞受体，纯化并测序（Vanderheijden等 2003 ;Wissink等2003)并且命名为SIGLEC1。这种分子与唾液酸粘附素有相似性并且经 证实介导PRRSV进入非易感细胞，但是表达这种受体的重组细胞系不能支持PRRSV的生产 性复制（Vanderheijden等2003)。重要的是，已经证实感染肺泡巨噬细胞需要PRRSV表面 存在的唾液酸分子。病毒与这种受体结合后，PRRSV的进入通过受体介导的胞吞作用发生 (Nauwynck等1999)。通过实验确定唾液酸粘附素对PRRSV进入的关键作用，其中证明在感 染克隆猪唾液酸粘附素的PK15细胞（不容许PRRSV复制的细胞系）中，而不是未感染的对 照PK15细胞中病毒吸收（Vanderheijden等2003)。这同一组的进一步研究证明，PRRSV病 毒粒子表面的唾液酸与唾液酸粘附素分子的相互作用对于PRRSV感染肺泡巨噬细胞是必 需的（Delputte和Nauwynck2004)。相反的策略，即去除PRRSV表面的唾液酸或用唾液酸 特异性凝集素预培养也导致感染中断（Delputte等2004 ;Delputte和Nauwynck2004;Van Breedam等2010b)。不依赖于对PRRSV进入的具体研究，已经使用定点诱变鉴定鼠唾液酸粘 附素结合唾液酸所需的六个关键氨基酸残基（Vinson等1996)，其与猪唾液酸粘附素69% 相同。重要的是，鼠唾液酸粘附素中鉴定的6个氨基酸在猪本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，所述方法包括：为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活的CD163等位基因；和激活所述卵母细胞以产生胚胎。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R·S·普莱特尔，K·韦尔斯，K·惠特沃思，
申请(专利权)人：密苏里大学管理者，
类型：发明
国别省市：美国;US
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