无机焦磷酸盐及其用途制造技术

本发明专利技术提供了包含一定量的无机焦磷酸盐(PPi)的新型且改进的精子刺激添加剂。在用于人/动物体外受精(IVF)的介质中添加PPi改善了受精率；在用于农场动物人工授精(AI)的精液延长剂中添加PPi可以改善受孕率；此外，在包括PPi的介质中体外成熟的哺乳动物卵母细胞达到改善的受精和发育潜能，而在补充PPi的介质中培养的胚胎向囊胚的发育得到改善。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用相关申请本申请要求2011年12月9日提交的美国临时申请系列号61/630,345的优先权，所述申请的完整公开内容通过引用并入本文。关于联邦资助的研究的声明本专利技术是在来自USDA国家食品和农业研究院(USDA-NIFA)的拨款号2007-35203-18274和2011-67015-20025的政府支持下进行的。政府在本专利技术中具有某些权利。
本专利技术涉及用于人工授精的组合物及使用方法。更具体地，本专利技术涉及用于农场动物的人工授精和人类不孕临床中的体外受精和胚胎培养的精子刺激添加剂。
技术介绍
人工授精(AI)是猪和牛养殖中的常用技术。新鲜射精的公猪精液必须储存在延长剂溶液中用于在15-18℃或4-5℃保存，公牛精液必须在液氮中冷冻保存和储存之前进行延长。已经开发各种类型的延长剂溶液和化合物，以降低精子代谢活性并允许延长保存。然而，需要新型且改进的培养基和/或精子延长剂，以改善动物中的人工授精和人类中的体外受精和胚胎培养。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了包含无机焦磷酸盐(PPi)的精子保存介质。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约10μM。在又另一个实施方案中，保存介质用于保存来自猪的精子。在另一个方面，本专利技术提供了包含无机焦磷酸盐(PPi)的精子转移的介质。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。本专利技术的另一个方面提供了包含无机焦磷酸盐(PPi)的体外受精(IVF)或人工授精(AI)的介质。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。在另一个方面，本专利技术提供了精液性别鉴定方法，其包括：(a)在洗脱介质的帮助下将第一培养介质中的混合的精子悬浮液分为具有x或具有y的精子的群体；(b)在第二培养介质中保存具有x或具有y的精子，其中，将无机焦磷酸盐(PPi)添加至第一培养介质、洗脱介质或第二培养介质中。在又另一个方面，本专利技术提供了精子保存的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐(PPi)的介质中储存精子。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在其它实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM，或PPi的浓度为约10μM。在又另一个实施方案中，将精子在包含PPi的介质中储存最多达10天。本专利技术的另一个方面提供了体外受精(IVF)的方法，其包括在无机焦磷酸盐(PPi)存在的情况下将卵母细胞与精子接触。在一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约200μM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约1μM至约20μM。在另一个实施方案中，在PPi存在的情况下储存精子。在另一个方面，本专利技术提供了培养胚胎的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐的介质中培养胚胎。在又另一个方面，本专利技术提供了人工授精的方法，其包括将精子和无机焦磷酸盐(PPi)提供至雌性的生殖道。在一个实施方案中，将PPi逐渐释放到雌性的生殖道。本专利技术的另一个方面提供了体外成熟卵母细胞的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐的介质中培养卵母细胞。附图说明图1：显示通过荧光分析测量焦磷酸盐(PPi)含量。(A)PPi标准品(最终浓度0-200μM PPi)的荧光强度。(B)用公猪精浆(SP)、猪输卵管液(pOVF)、兔血清、小鼠血清(最终浓度10μg/ml)、公猪精子(1x106个精子/ml)和10mM H2O2工作溶液(阴性对照)的PPi测定。在多个时间点测量荧光强度以遵循反应动力学(激发530nm；发射590nm)。重复实验三次。值表示为荧光强度的平均值。图2：显示PPi的生成。PPi由细胞中ATP水解成AMP而产生。无机焦磷酸酶(PPA1)催化PPi的水解，以形成2个正磷酸盐(2Pi)，导致能量释放。图3：显示通过Western印迹检测无机焦磷酸酶(PPA1)。提取公猪精浆(SP；20μg/ml)、猪输卵管液(pOVF；100μg/ml)和公猪、公牛、小鼠和人精子(均为1x106个精子/ml)以进行蛋白分析。使用相等蛋白上样量。通过兔多克隆抗PPA1抗体检测～32kDa的明显条带。来自酿酒酵母的纯化PPA1(最右侧泳道；1μg/ml；Sigma I1643)用作对照蛋白。图4：显示通过免疫荧光定位精子中的无机焦磷酸酶(PPA1；红)。(A,B)公猪精子的全封固免疫荧光。在精子尾部连接件和精子头部的顶体后鞘中观察到最显著的标记。(C)在IVF过程中配子混合后30min时，在附着至卵母细胞透明带的精子中观察到相同的标记。(D)用全长PPA1蛋白免疫饱和的抗PPA1抗体的阴性对照。DNA用DAPI(蓝色)复染。落射荧光显微照片与用DIC光学获得的齐焦透射光照片重叠。图5：显示在有/无PPi的情况下精子储存过程中的精子活力和线粒体膜电位。(A)基于SYBR14(活精子)和PI(死精子)标记的活精子的百分比。(B)具有极化(活)、正在去极化(正在死亡)和去极化(死亡)线粒体膜的精子的百分比。重复实验三次。值表示为荧光强度的平均百分比±SEM。各组列中不同的上标a&b表示p<0.05的显著性差异。图6：显示PPi对储存的公猪精子的蛋白酶体酶活性的影响。将新鲜公猪精子储存在有和没有10μM PPi的BTS中3或10天(未处理/PPi+BTS)。使用特异性荧光底物Z-LLE-AMC(A)、Z-LLVY-AMC(B)、Z-LLL-AMC(C)和泛素-AMC(D)测量蛋白酶体蛋白水解和去泛素活性。在独立处理中，在测量前将PPi添加至没有PPi的情况下保存的精子中(添加PPi)。作为阴性对照，在第3天将10μM MG132(蛋白酶体抑制剂)添加至“未处理”和“PPi+BTS”精子。重复实验三次。值表示为荧光强度的平均值。图7：显示PPi对IVF过程中总精子和多精子受精的影响。值表示为荧光强度的平均百分比±SEM。□％单精子和■％多精子卵母细胞。各组列中不同的上标a-c表示p<0.05的显著性差异。授精的卵子数标明在括号中。(A)在渐增浓度PPi存在的情况下用1×106个精子/ml的标准浓度授精体外成熟的猪卵母细胞。重复实验五次。(B)反映体外精本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含无机焦磷酸盐(PPi)的精子保存介质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.09 US 61/630,3451.包含无机焦磷酸盐(PPi)的精子保存介质。
2.权利要求1的精子保存介质，其中PPi的浓度为约1μM至约
200μM。
3.权利要求1的精子保存介质，其中PPi的浓度为约1μM至约
20μM。
4.权利要求1的精子保存介质，其中PPi的浓度为约10μM。
5.权利要求1的精子保存介质，其中所述保存介质用于保存来自
猪的精子。
6.包含无机焦磷酸盐(PPi)的精子处理介质。
7.权利要求6的介质，其中PPi的浓度为约1μM至约200μM。
8.权利要求6的介质，其中PPi的浓度为约1μM至约20μM。
9.包含无机焦磷酸盐(PPi)的用于体外受精(IVF)或人工授精(AI)的
介质。
10.权利要求9的介质，其中PPi的浓度为约1μM至约200μM。
11.权利要求9的介质，其中PPi的浓度为约1μM至约20μM。
12.一种精液性别鉴定方法，包括：
(a)在洗脱介质的帮助下将第一培养介质中的混合的精子悬浮液
分为具有x或具有y的精子的群体；
(b)在第二培养介质中保存具有x或具有y的精子，
其中，将无机焦磷酸盐(PPi)添加至...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·索托维斯基，李映周，
申请(专利权)人：密苏里大学管理者，
类型：发明
国别省市：美国;US