核酸扩增产物实时检测装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种核酸扩增产物实时检测装置，其能够有效地排除或降低装置方面的致误差因素，而无需使用用于修正的第2荧光信号。对多个孔(7A)实施温度循环，并实时检测来自各孔(7A)中的核酸扩增产物的荧光强度。检测得自孔(7A)的荧光测定值[DNA]raw、以及得自该孔(7A)邻近周边的连接壁的荧光测定值[DNA]bg，通过从荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg来确定该孔(7A)的荧光强度[DNA]real。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及对聚合酶链反应(polymerase chain reactin:PCR)所得多核苷酸产物进行实时检测的装置。
技术介绍
PCR是对DNA链进行复制的循环性酶反应，其出于以下原因能够对作为目标的目标序列分子进行指数函数式的扩增:将在先循环中复制的PCR产物(核酸扩增产物)用作在后循环的模板。在实时 PCR中，例如使用相干的两种荧光染料标记的序列特异性探针(TaqMan探针)，用激发光照射PCR产物，激起荧光并测定荧光强度，从而对PCR产物的扩增进行实时监测。而且，当用于定量时，对于已知样品扩增曲线的指数函数扩增范围设定阈值(图7的(6))，然后计算出该阈值与扩增曲线的交点(阈值循环数Ct，图7的(8))。当以Log值的形式来表示初期DNA量时，该阈值循环数Ct与检测样品的初期DNA量之间存在线性关系，可以制作出表示该线性关系的校正曲线。以该校正曲线为基准可以推知检测样品的初期DNA量。这样，就能够基于PCR的扩增速度理论进行准确的定量。在这里，由于实际的PCR效率不是100%，扩增出的PCR产物的浓度可以以式⑴表/Jn ο = 0(l+e)c....(I):PCR产物的浓度 ^:目标模板的初期浓度e:平均PCR效率c:循环数S卩，如果平均PCR效率e为100% (即，上式(I)中e=l)，则PCR产物的浓度为2的循环数次方，呈指数函数式地扩增。然而，在循环的初期、中期和后期，效率e逐渐降低，扩增曲线为图7所示的状况。图7的横轴为循环数、纵轴为荧光强度，循环初期以指数函数的形式扩增(图7的(5))，循环中期以线性函数的形式扩增(图7的(6))，而循环后期则由于平台效应而不再扩增(图7的(7))。而且，引起平台效应的化学反应方面的因素如下。.dNTP和引物的水解.DNA聚合酶(生产模板拷贝的DNA合成酶)的热失活.单链PCR片段的复性引起的引物退火效率降低 非特异性PCR产物的竞争因素.焦磷酸酯等PCR抑制物的积累.DNA聚合酶的外切酶活性引起的PCR产物水解因此，实时PCR的前提条件是在上式(I)的关系成立的指数函数扩增范围内进行测定(专利文献I)。专利文献1:特表2005-516630号公报专利文献2:专利第2909216号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的问题此外，作为实时PCR中使用的反应容器，一般使用称作微孔板的具有多个孔(由凹陷构成的反应区，例如96个)的容器。虽然向各孔中分加了一定初期DNA浓度的反应溶液，但由于装置方面的下述误差因素，反应容器的各个孔的扩增曲线存在偏差。.光学系统的误差.校正溶液的浓度误差.校正溶液的分加误差 .反应容器的盖或封口膜的光透过性误差.反应容器的污染误差.反应溶液的分加误差这里，由于价格低廉的关系，下述方法成为给反应容器(微孔板)的孔加盖的主流方法:在反应容器的一面的整个区上粘贴带有粘合剂的前述封口膜。而且，激发光通过封口膜照射到各孔，PCR产物(反应产物)发出的荧光也是通过封口膜才被CCD相机等光检测部检测到(这些构成装置的光学系统)。这样，虽然封口膜、反应容器本体构成了荧光强度测定方面的光学系统的重要要素，但是，这些均属易耗品，很难指望它们具有均一且高精度的光学性能。图4为光检测部所检测到的PCR前的反应容器的实际图像。从整体来看，反应容器的孔的周围是黑色的，但是，作为背景的该图像各像素的亮度(背景荧光强度)却并非一定，如该图的(I)中所示，由于光学系统的污染、杂散光(迷走光)等出现了斑点。如果开始PCR反应，则该斑点会如图5的⑵中所示那样，与孔部分的图像(图5中显示为圆形的96个图像)重叠，而被孔本体的荧光强度拉长。因而，传统上，首先准备未装入DNA的空反应容器，对于各个孔，分别测定空孔状态的荧光强度，将其作为标准校正值进行存储。然后，通过进行如下的校正处理，进行这样的光学系统的校正，所述校正处理为:从实际荧光强度的测定值中减去存储的校正值。然而，归因于空反应容器污染的误差是各反应容器固有的，存在的问题是:当使用被认定为标准的来自其它空反应容器的校正值时，在测定值方面会产生误差。此外，在专利文献2中，使用第2荧光信号对第I荧光信号进行修正，然而，除了本来必须测定的发出第I荧光的溶液之外，还必须再加上发出参照用的第2荧光的溶液，这样不但操作复杂，而且成本激增。此外，必须非常高精度地分注发出第2荧光的溶液并高精度地进行测定，才能有效果。此外，还存在的问题是:为测定第2荧光必须安装特殊的滤光器(光学7 ^ )，还有获取和处理数据需要相当长的时间，例如每次测定均需要交替使用发出第I荧光溶液用滤光器和发出第2荧光溶液用滤光器。本专利技术是为了解决这些传统技术上的问题而完成的，其目的是提供一种核酸扩增产物实时检测装置，该核酸扩增产物实时检测装置能够有效地排除或降低装置上的误差因素，而不使用用于修正的第2荧光信号。解决问题的方法权利要求1的专利技术的装置对多个反应区实施温度循环，对各反应区中的来自核酸扩增产物的荧光强度进行实时检测，其中，通过检测得自反应区的荧光测定值raw和得自该反应区附近的反应区外区域的荧光测定值bg、并从荧光测定值raw中减去荧光测定值bg来确定该反应区的荧光强度real。权利要求2的专利技术的装置，其特征在于:在上述专利技术中，荧光测定值bg为得自反应区附近的多个反应区外区域的荧光测定值的简单平均、或者经过指定加权后的平均值。权利要求3的专利技术的装置，其特征在于:在上述各专利技术中，在每次检测荧光测定值 raw时，检测荧光测定值bg，从该荧光测定值 raw中减去荧光测定值bg，这样来确定荧光强度real。权利要求4的专利技术的装置对多个反应区实施温度循环，实时检测各反应区中的来自核酸扩增产物的荧光强度，其中，对于每个温度循环的从各反应区得到的荧光强度η(第η个循环的荧光强度)，使用该荧光强度n的最大值或与之相关的值max进行标准化，对于使用该标准化的荧光强度nN绘制的扩增曲线的指数函数扩增区设定阈值Th，由此来计算出阈值循环数Ct。权利要求5的专利技术·的装置，其特征在于:在上述专利技术中，通过用每个反应区的荧光强度n除以下述值来计算出荧光强度nN，其中，所述值为:最大值或与之相关的值max、或者将max加上作为比较对象的反应区共有的值而得的值。权利要求6的专利技术的装置，其特征在于:在权利要求4或权利要求5中，从各反应区的荧光强度η及最大值或与之相关的值max中减去指数函数扩增区以前的荧光强度base，这样来绘制扩增曲线。专利技术的效果本专利技术中，在对多个反应区实施温度循环、实时检测来自各反应区中的核酸扩增产物的荧光强度的核酸扩增产物实时检测装置中，检测得自反应区的荧光测定值raw和得自该反应区附近的反应区外区域的荧光测定值bg，从该荧光测定值raw中减去荧光测定值bg，由此来确定该反应区的荧光强度real，因此，对于每个反应区，能够分别获得该反应区的核酸扩增产物固有的荧光强度 real，其中扣除了归因于该反应区及其周围的光透过性误差、污染、杂散光的背景荧光强度。这样一来，可以实现准确的扩增曲线的制作和定量化。这种情况下，不需要使用第2荧光信号，因此，不会造成成本增加或操作困难，数据的获取和处理所需的时间也会缩短。在权利要求2的专利技术中，在上述专利技术的基础上，荧光测定值本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增产物实时检测装置，该装置对多个反应区实施温度循环，实时检测来自各反应区中的核酸扩增产物的荧光强度，其中，检测从所述反应区得到的荧光测定值[DNA]raw、以及从该反应区附近的反应区外区域得到的荧光测定值[DNA]bg，并从所述荧光测定值[DNA]raw中减去所述荧光测定值[DNA]bg，由此来确定该反应区的荧光强度[DNA]real。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：玉置裕一，岩间明文，园田泰亮，
申请(专利权)人：松下健康医疗器械株式会社，
类型：发明
国别省市：