16S-23S rRNA ISR PCR扩增进产物的PAGE分析方法技术

１６Ｓ－２３Ｓ　　ｒＲＮＡ　　ＩＳＲ　　ＰＣＲ扩增进产物的ＰＡＧＥ分析方法属于分子生物学技术领域。本发明专利技术是采用Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　　Ｇｅｌ　　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）的分析技术对１６Ｓ－２３Ｓ　　ＩＳＲ　　ＰＣＲ的扩增产物进行分析。本发明专利技术所达到的有益效果和益处是，放弃使用比较昂贵的ＤＧＧＥ技术，在减少费用的同时，增加了该技术的可操性、可行性和可推广性。本发明专利技术主要适用于微生物遗传多样性分析与指纹图谱的建立。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡＩＳＲＰＣＲ扩增进产物的ＰＡＧＥ分析方法，其特征在于，步骤如下：（１）３０％丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺固体１５０ｇ、Ｎ，Ｎ’－甲叉双丙烯酰胺固体５ｇ分别溶于２００ｍｌ水中，溶解后混合定容至５００ｍｌ，过夜搅拌，若仍有不溶物质或杂质，用滤纸过滤；（２）１０×ＴＢＥＢｕｆｆｅｒ２Ｌ：将２１８ｇＴｒｉｓ和１８．４ｇＥＤＴＡ溶于少量水中，然后加入ＨＢＯ定容至２Ｌ，充分溶解，调ｐＨ值为７．５－８．３；（３）取６ｍｌ的３０％丙烯酰胺和３ｍｌ１０×ＴＢＥＢｕｆｆｅｒ溶于２１ｍｌ的ｄＨ２Ｏ，混匀；加入１０％过硫酸氨１００μｌ，ＴＥＭＥＤ　１０μｌ，并上混匀；加入灌胶板水平放置，插入梳子，室温凝胶６０－８０ｍｉｎ；（４）拔去梳子，用水洗涤加样孔；（５）将制成的６％ＰＡＧＥ玻璃胶板放到盛有１×ＴＢＥ缓冲液电泳槽中，用夹子将两端固定；（６）往上槽中注入足以覆盖住样品的电泳缓冲液；（７）用一毫升枪头将样品孔中的气泡吹打出来；（８）小电压空跑５－１０分钟；（９）用微量加样器将扩增产物３０μｌ与６×ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ混匀，用ＳｍａｒｔＳｙｃｌｅｒ专用枪头上样；（１０）２００Ｖ、２０ｍＡ条件下预跑２０ｍｉｎ，待样品进入凝胶后，加大电压至６００Ｖ，电泳３ｈｒｓ；（１１）电泳后，将胶板起开，取下ＰＡＧＥ胶，放置到塑料含有溴乙腚ＥＢ染液槽中放置２０－３０ｍｉｎ；（１２）应用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＶＤＳＳｙｓｔｅｍ的紫外光透射进行成像。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王耀兵，宫强，李冬梅，
申请(专利权)人：国家海洋环境监测中心，
类型：发明
国别省市：91[]