本发明专利技术提供了快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其包括与糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物序列，以及人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、预扩增产物纯化试剂、PCR产物单碱基延伸反应液和延伸产物纯化试剂；本发明专利技术还提供一种该试剂盒的制备方法，采用敏感性及特异性均较高的基因测序法检测糖尿病视网膜病变相关的SNP位点，可以快速、有效、准确、经济地检测出23个糖尿病视网膜病变相关基因多态性位点的基因型，为糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后提供参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及糖尿病视网膜病变早期诊断和临床预后评价中相关基因多态性的检测试剂盒，以及该试剂盒制备和在糖尿病视网膜病变早期诊断和临床预后评价中的用途。本专利技术涉及的糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism, SNP)位点，23个SNP位点突变或其中几个突变可诊断糖尿病视网膜病变以及评价该患者的临床预后状況。
技术介绍
目前,糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，也是ー种世界范围内主要的致盲性眼病，是遗传因素与环境因素共同作用的結果。目前仅能通过询问临床病史、观察患者是否具有典型的DR临床表现确诊。对于临床表型不典型的DR、潜在DR的糖尿病患者，以及发病初期的DR患者，由于缺乏基础 临床表现而难以在做出准确诊断。糖尿病视网膜病变是ー个多基因、多阶段疾病，其发病机制复杂，目前公认的学说有醛糖还原酶途径、非酶性糖基化作用、蛋白激酶C激活、血管舒张性前列腺素产物、视网膜生长因子产生、视网膜毛细血管血流改变等，整个病理过程涉及代谢酶、炎症、细胞因子、信号转导及离子通道等相关基因的变化。基因多态性是指人类基因组中同一位置的基因或DNA序列具有不同类型，在人群中具有一定的分布频率。在基因组中，不同个体DNA序列上的单个碱基的差异称为单核苷酸多态性。近年来，随着基因多态性与糖尿病视网膜病变关系的研究不断深入和扩展，已经筛选出可能与之相关的数十种基因。目前，还没有专门针对糖尿病视网膜病变相关基因进行检测的成熟产品和方法。本专利技术针对世界范围内已报道的糖尿病视网膜病变相关基因多态性，专利技术了检测糖尿病视网膜病变23个相关基因多态性的试剂盒产品及其制备方法，其中分别为脂肪炎症因子的6个SNP位点、血管紧张素II I型受体相关受体的5个SNP位点以及血管内皮生长因子A的12个SNP位点，可以快速、有效、准确、经济地检测出23个糖尿病视网膜病变相关基因多态性位点，为糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后提供有价值的指导。
技术实现思路
糖尿病视网膜病变是个多基因疾病，整个发病过程中涉及代谢酶、炎症、细胞因子、信号转导及离子通道等相关基因的变化，这些遗传基因多态性与DR的发病和发展密切相关。本专利技术遴选出与糖尿病视网膜病变密切相关的23个关键的单核苷酸多态性位点，其中分别为脂肪炎症因子的6个SNP位点、血管紧张素II I型受体相关受体的5个SNP位点以及血管内皮生长因子A的12个SNP位点，通过提取基因组DNA并进行聚合酶链式反应(PCR)及测序检测SNP位点突变状况，早期诊断和临床预后评价糖尿病视网膜病变。本专利技术涉及ー种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物。本专利技术涉及快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物，其序列如下权利要求1.一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物；其中，所述的与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物的序列如下序号位点名称扩增引物名称扩增引物序列2.一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，其包括 人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、预扩增产物纯化试剂、PCR产物单碱基延伸反应液和延伸产物纯化试剂； 其中，人外周血基因组DNA提取液包括去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇混合液，异丙醇和无水乙醇； PCR预扩增反应液包括10 X PCR缓冲液，2U-5U的Taq酶，O. 2 I. OmM的dNTPs，权利要求I所述的1-11SNP位点的预扩增引物混合物，以及权利要求I所述的12-23SNP位点的预扩增引物混合物，该两种预扩增引物混合物的用量分别都为O. 2 μ mol ; 阴性对照为去离子水； 阳性对照为已知基因型人基因组DNA样品； 预扩增产物纯化试剂为虾碱性磷酸酶SAP和核酸外切酶ExoI ； PCR产物单碱基延伸反应液包括5 μ I预反应混合液、权利要求I所述的1-11SNP位点的预扩增引物相对应的的11个延伸引物，与权利要求I所述的12-23SNP位点的预扩增引物相对应的的11个延伸引物混合物，上述两种延伸引物混合物的用量分别都为O. 2 μ mol ；延伸产物纯化试剂为6 μ I的碱性磷酸酶CIP。3.—种如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，其使用步骤如下 步骤一，糖尿病视网膜病变患者外周血样本23个SNP位点PCR预扩增 取来自糖尿病视网膜病变患者外周血10ml，按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提患者外周血中基因组DNA，取2μ I用IXTAE缓冲液加热溶解的I %琼脂糖凝胶进行电泳，检测DNA质量，所述百分比为m/v ； 获取的糖尿病视网膜病变患者外周血样本基因组DNA模板后，提取的基因组DNA为多重PCR预扩增模板，进行PCR预扩增，目的富集延伸模板； PCR预扩增反应条件如下 DPCR反应体系如下4.一种如权利要求1-3所述的快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒的制备方法。5.根据权利要求I 3任一项所述的试剂盒在检测糖尿病视网膜病变相关的23个基因多态性中的应用。全文摘要本专利技术提供了快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其包括与糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物序列，以及人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、预扩增产物纯化试剂、PCR产物单碱基延伸反应液和延伸产物纯化试剂；本专利技术还提供一种该试剂盒的制备方法，采用敏感性及特异性均较高的基因测序法检测糖尿病视网膜病变相关的SNP位点，可以快速、有效、准确、经济地检测出23个糖尿病视网膜病变相关基因多态性位点的基因型，为糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后提供参考。文档编号C12Q1/68GK102851358SQ20121014878公开日2013年1月2日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日专利技术者曾沃坦, 焦剑, 金文俊, 梁辰, 陈初光 申请人:益百尚(北京)生物技术有限责任公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物；其中，所述的与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物的序列如下：所述的与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点单碱基延伸引物的序列如下：。FSA00000716886500011.tif,FSA00000716886500021.tif,FSA00000716886500022.tif,FSA00000716886500031.tif,FSA00000716886500041.tif
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾沃坦，焦剑，金文俊，梁辰，陈初光，
申请(专利权)人：益百尚北京生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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