食物中毒菌检测用载体以及食物中毒菌的检测方法技术

一种食物中毒菌检测用载体，其同时且特异性检测出大肠杆菌、李斯特菌、弯曲菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌中的二种以上的食物中毒菌。所述食物中毒菌检测用载体是将分别选自如下探针组的两个以上组中的一个或两个以上的探针固定化而得到，所述探针组包括：由序列编号1～6探针及其互补探针(以下相同)等组成的大肠杆菌检测用第一探针组；由序列编号7～13的探针等组成的李斯特菌检测用第二探针组；由序列编号14～19的探针等组成的弯曲菌检测用第三探针组；由序列编号20～24的探针等组成的副溶血弧菌检测用第四探针组；由序列编号25～29的探针等组成的金黄色葡萄球菌检测用第五探针组；由序列编号30～40的探针等组成的沙门氏菌检测用第六探针组；由序列编号41～49的探针等组成的蜡样芽孢杆菌检测用第七探针组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于检测食物中毒菌的微阵列等的载体，特别是涉及能够特异性地且同时检测出多种食物中毒菌的食物中毒菌检测用载体、以及食物中毒菌的检测方法。
技术介绍
以往，在食品检查或环境检查、临床试验、家畜卫生等方面上，进行是否存在食物 中毒菌的检查。在这样的检查中，近年来进行如下操作利用PCR(聚合酶链反应)，将检查试样中所包含的DNA扩增，根据所得到的扩增产物来检测对象菌。此时，在食物中毒菌的检测中广泛使用电泳，由此判定是否存在对象菌。另外，还通过将检测到的扩增产物精制，进行测序，从而进行正确的菌株的鉴定。但是，在利用电泳检测时，存在这样的问题难以辨别扩增大小相近的物质，因此难以识别菌株，其鉴定困难。此外，在利用电泳检测时，还有这样的问题凝胶制作等操作繁杂，使用致癌物质(溴化乙锭等)进行染色。另外还有测序是无迅速性、且操作困难这样的问题。因此，最近，除了利用电泳的检测之外，还逐渐进行使用DNA微阵列的检测。在DNA微阵列上固定与对象菌杂交的探针，使通过PCR而得到的扩增产物与该探针杂交，由此能够进行菌株级的识别，而与扩增片段大小无关。此外，利用DNA微阵列的检测由于不需要进行使用致癌物质等的染色，与测序相比，具有迅速性，操作简便。另外，还利用原位杂交法等，使通过PCR得到的扩增产物与探针杂交，检测对象菌。例如，在专利文献I中，公开了能够检测出如下细菌的探针和DNA微阵列酸热脂环酸芽抱杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、热坚芽抱杆菌(Bacilluscaldotenax)、腊样芽抱杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、普通嗜热放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepiderimidis)。此外，在专利文献2中，公开了能够检测出如下细菌等食物中毒细菌的探针、以及使用该探针利用原位杂交法检测食物中毒细菌的方法气单胞菌属细菌、李斯特菌、Welsh菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、病原性大肠杆菌。专利文献I :日本特开2008-200012号公报专利文献2 :日本特开2006-166912号公报
技术实现思路
专利技术要解决的课题目前，大肠杆菌、李斯特菌、弯曲菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌的七种食物中毒菌占细菌性食物中毒原因的90%以上。因此，如果能够同时且分别特异性地检测出这些七种食物中毒菌是否存在于食品或环境等中，则非常有用。但是，为了分别特异性地且同时一次性检测出这些多种食物中毒菌，探针需要优异的特异性。设计这样的探针是不容易的，以往未发现将能够一次性检测出这些多种食物中毒菌的探针固定化的DNA微阵列等。于是，本专利技术人进行了深入研究，反复进行了多次实验，结果成功地开发出，能够以上述七个菌种八个区域的毒素区域基因或生物体内必须基因为检测对象、分别特异性地且一次性检测出这些七个菌种的食物中毒菌的探针，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术的目的在于提供能够同时且特异性地一次性检测出大肠杆菌(Escherichia coli)、李斯特菌(Listeria 属)、弯曲菌(Campylobacter 属)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella属)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)中的两种以上的食物中毒菌的食物中毒菌检测用载体、以及食物中毒菌的检测方法。 用于解决课题的手段本专利技术的食物中毒菌检测用载体是将分别选自如下探针组的两个以上组中的一个或两个以上的探针固定化而形成，所述探针组包括用于检测大肠杆菌的由具有序列编号I 6所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的碱基序列的探针组成的第一探针组；用于检测李斯特菌的由具有序列编号7 13所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的碱基序列的探针组成的第二探针组；用于检测弯曲菌的由具有序列编号14 19所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的碱基序列的探针组成的第三探针组；用于检测副溶血弧菌的由具有序列编号20 24所不的喊基序列的探针以及具有与它们互补的喊基序列的探针组成的第四探针组；用于检测金黄色葡萄球菌的由具有序列编号25 29所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的碱基序列的探针组成的第五探针组；用于检测沙门氏菌的由具有序列编号30 40所不的喊基序列的探针以及具有与它们互补的喊基序列的探针组成的第六探针组；以及用于检测蜡样芽孢杆菌的由具有序列编号41 49所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的喊基序列的探针组成的第七探针组。本专利技术的食物中毒菌的检测方法如下使用含有由如下引物对组成的组中的两个以上的引物对、试样的基因组DNA、核酸合成酶和核酸合成底物的PCR用反应液，在所述试样中包含对应于所述两个以上的引物对中的至少一个引物对的食物中毒菌的基因组DNA时，利用PCR法扩增该食物中毒菌的核酸，所述引物对包括用于扩增大肠杆菌的DNA的、具备由序列编号50所示的碱基序列组成的引物和由序列编号51所示的碱基序列组成的引物的第一引物对；用于扩增李斯特菌的DNA的、具备由序列编号52所不的喊基序列组成的引物和由序列编号53所不的喊基序列组成的引物的第二引物对；用于扩增弯曲菌的DNA的、具备由序列编号54所示的碱基序列组成的引物和由序列编号55所示的碱基序列组成的引物的第三引物对；用于扩增副溶血弧菌的DNA的、具备由序列编号56所示的碱基序列组成的引物和由序列编号57所示的碱基序列组成的引物的第四引物对；用于扩增金黄色葡萄球菌的DNA的、具备由序列编号58所示的碱基序列组成的引物和由序列编号59所示的碱基序列组成的引物的第五引物对；用于扩增沙门氏菌的DNA的、具备由序列编号60所示的碱基序列组成的引物和由序列编号61所示的碱基序列组成的引物的第六引物对；用于扩增蜡样芽孢杆菌的DNA的、具备由序列编号62所示的碱基序列组成的引物和由序列编号63所示的碱基序列组成的引物的第七引物对；以及用于扩增蜡样芽孢杆菌的DNA的、具备由序列编号64所示的碱基序列组成的引物和由序列编号65所示的碱基序列组成的引物的第八引物对；使所述通过扩增而得到的扩增产物与将探针固定化而得到的食物中毒菌检测用载体接触，并使之与所述固定化的探针杂交，由此检测出食物中毒菌，所述探针为分别选自如下探针组中的对应于与所述两个以上的引物对所对应的食物中毒菌的两个以上组中的一个或两个以上的探针，所述探针组包括用于检测大肠杆菌的由具有序列编号I 6所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的碱基序列的探针组成的第一探针组；用于检测李斯特菌的由具有序列编号7 13所不的喊基序列的探针以及具有与它们互补的喊基序列的探针组成的第二探针组；用于检测弯曲菌的由具有序列编号14 19所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的碱基序列的探针组成的第三探针组；用于检测副溶血弧菌的由具有序列编号20 24所示的碱基序列的探针以及具有与它们互补的碱基序列的探针组成的第四探 针组；用于检测金黄色葡萄球菌的由具有序列编号25 29所示的碱基序列的探针以及具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：山崎隆明，原田天章，猿渡由宽，龟井修一，
申请(专利权)人：东洋制罐株式会社，东洋钢钣株式会社，
类型：
国别省市：