一种铜绿假单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和降解TNT的方法技术

本发明专利技术涉及有机物污染的生物修复技术领域，公开了一种铜绿假单胞菌、含有该菌的菌剂及其在降解TNT中的应用和一种降解TNT的方法，其中，所述铜绿假单胞菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：10842。本发明专利技术的降解TNT的方法包括：将保藏号为CGMCC NO：10842的铜绿假单胞菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10842的铜绿假单胞菌的菌剂与TNT污染样品接触，以对TNT污染样品中的TNT进行降解。本发明专利技术的铜绿假单胞菌具有较高的TNT降解能力，且在高盐环境下对TNT依然具有良好耐受能力和高降解能力，可在TNT污染的土壤或含TNT的废水的生物修复过程中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及有机物污染的生物修复
，具体地，涉及一种铜绿假单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种降解TNT的方法。
技术介绍
TNT(三硝基甲苯)是一种常见的合成单体炸药，工艺成熟、价格低廉、性能稳定、操作安全，故在国防和民用领域应用广泛。但其对于生物具有致毒、致癌、致突变的作用，同时埋藏在地下的TNT亦有可能存在重大安全隐患。故TNT类化合物在生产、储存、使用和销毁过程中若进入环境中将严重破坏当地的生态环境，威胁人类及其他生命的生存，已成为全球关注的一大焦点。对于TNT的污染，生物修复技术具有操作简单、效率高、反应温和、不易造成二次污染等特点。然而包括TNT在内的硝基芳香烃是一类人工合成的化合物，在自然界本不存在利用该类物质的生物体，土著微生物难以有效的对其进行利用。而当大量TNT类化合物进入环境中造成环境胁迫压力时，部分环境微生物通过诱导产生相关的酶，利用其进行生长，从而达到提高TNT污染土壤的生物修复效率的目的。故进行TNT污染高效降解菌株的筛选，是进行TNT污染土壤生物修复的重要一步。微生物降解TNT的机理主要是对苯环上的硝基进行依次还原，或者对苯环进行加氢还原。前者通常产生单氨基、双氨基等还原产物，或形成偶氮二聚体，不易被进一步降解；后者通常产生亚硝酸根离子和二硝基甲苯，亚硝酸根离子可作为微生物生长繁殖的氮源，二硝基甲苯亦有报道可被彻底矿化、释放亚硝酸根。目前，人们已经筛选获得了一些可以降解TNT等硝基芳香烃的微生物，包括细菌、真菌等。由于真菌代谢易受TNT抑制，且难以在修复过程中定殖，而细菌由于适应环境能力较强更多的被应用于生物修复过程中。α-变形菌纲、γ-变形菌纲、放线菌门和厚壁菌门的一些微生物已经被报道具有TNT的降解能力。然而，在实际生物修复应用中具有高TNT降解能力，尤其是在高盐环境下对TNT依然具有良好耐受能力和高降解能力的微生物鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服TNT污染生物修复中存在的上述缺陷，提供一种铜绿假单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种降解TNT的方法。本专利技术的铜绿假单胞菌，具有较高的TNT降解能力，且在高盐环境下对TNT依然具有良好耐受能力和高降解能力。为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一种具有较高的TNT降解能力，且在高盐环境下对TNT依然具有良好耐受能力和高降解能力的铜绿假单胞菌。因此，第一方面，本专利技术提供了一种铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，该铜绿假单胞菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO：10842。第二方面，本专利技术提供了一种含有上述铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的菌剂。第三方面，本专利技术提供了上述铜绿假单胞菌和/或上述菌剂在降解TNT中的应用。第四方面，本专利技术提供了一种降解TNT的方法，所述方法包括：将上述铜绿假单胞菌和/或上述菌剂与TNT污染样品接触，以降解TNT污染样品中的TNT。本专利技术的铜绿假单胞菌对TNT的降解过程为苯环直接还原反应和硝基还原反应共存，并以前者为主，后者仅在生长初期出现。与现有技术相比，本专利技术的铜绿假单胞菌具有较高的TNT降解能力，且在高盐环境下对TNT依然具有良好耐受能力和高降解能力，可在TNT污染的土壤或含TNT的废水的生物修复过程中发挥重要作用。本专利技术的铜绿假单胞菌在TNT为单一氮源时能够正常生长繁殖，且将1mLOD600为3的铜绿假单胞菌的生理盐水菌液加入至100mL100ppmTNT作为氮源、葡萄糖(5g/L)作为碳源的液相培养基中，该铜绿假单胞菌可在66h内完全降解TNT成分。在使用本专利技术的铜绿假单胞菌进行TNT污染生物修复的过程中加入氮源，如加入铵盐(NH4)2SO4，可以有效刺激该菌生长，加速TNT降解效率。将1mLOD600为3的铜绿假单胞菌的生理盐水菌液加入至100mL100ppmTNT作为氮源、葡萄糖(5g/L)作为碳源、加入有1g/L(NH4)2SO4的液相培养基中，该铜绿假单胞菌完全降解TNT的时间由66h缩短至36h。本专利技术的铜绿假单胞菌在高盐条件(如液相培养基中含有8质量％Na2SO4)下，能够正常生长，并对TNT依然有较高的降解率。将1mLOD600为3的铜绿假单胞菌的生理盐水菌液加入至100mL100ppmTNT作为氮源、葡萄糖(10g/L)作为碳源、加入有1g/L(NH4)2SO4和8质量％Na2SO4的液相培养基中，该铜绿假单胞菌在48h内可降解约56％的TNT。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1为本专利技术的保藏号为CGMCCNO：10842的铜绿假单胞菌对液体培养基M中TNT降解的效果图。生物保藏本专利技术的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC：10842。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。第一方面，本专利技术提供了一种铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，该铜绿假单胞菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO：10842。本专利技术的保藏号为CGMCCNO：10842的铜绿假单胞菌，来源于受到TNT污染的土壤样本，经由液相富集法分离纯化获得。生物学特性为：短杆状、周生鞭毛，能够分泌大量胞外分泌物；尿素水解实验、硫化氢实验、吲哚实验阴性，过氧化物酶实验、明胶水解酶实验、V.P实验、柠檬酸盐利用实验阳性；可利用葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、阿拉伯糖和木糖。其中，本专利技术的铜绿假单胞菌的分离过程可以包括：采集某兵器制备工厂受到TNT污染的土壤样本，采用液相富集法以及直接稀释涂平板法驯化降解菌，培养基成分为MB基础培养基+10g/L葡萄糖+1g/L(NH4)2SO4+100ppmTNT以及LB固体培养基。经过反复多代驯化，在LB固体培养基上划线培养分离单菌落，得到铜绿假单胞菌LWC-4，活化后将1mLOD600为3的铜绿假单胞菌LWC-4的菌液接种至100mL液体培养基P中验证其降解TNT的能力，其中液体培养基P的组成为5g/L葡萄糖+1g/L(NH4)2SO4+100ppmTNT。使用高效液相色谱(高效液相色谱仪型号为LC-20A，购自日本岛津公司，色谱柱为安捷伦ZORBAXSB-Aq(4.6mm×150mm×5μm)，流动相为0.005mol/LH2SO4，流速为1.0ml/min，柱温箱为65℃)检测TNT含量及代谢产物。结果表明在液体培养基P中，该菌株具有较高的TNT降解能力，在36h内可完全降解TNT。对菌株LWC-4进行生理生化鉴定分析，其生物学特性为：短杆状、周生鞭毛，能够分泌大量胞外分泌物；尿素水解实验、硫化氢实验、吲哚实验阴性，过氧化物酶实验、明胶水解酶实验、V.P实验、柠檬酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其特征在于，该铜绿假单胞菌的保藏号为CGMCC NO：10842。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，其特征在于，该铜绿假单胞菌的保藏号为CGMCCNO：10842。2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。3.根据权利要求2所述的菌剂，其中，该菌剂含有所述铜绿假单胞菌的活菌体。4.权利要求1所述的铜绿假单胞菌和/或权利要求2或3所述的菌剂在降解TNT中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其中，TNT源为TNT污染的土壤或含TNT的废水。6.一种降解TN...

【专利技术属性】
技术研发人员：任立伟，朗喆，林森，王培红，
申请(专利权)人：粮华生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11