一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法,检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液，阳性对照，阴性对照和内标；PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；引物包括上游引物和下游引物；检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液和内标；PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上游引物、用于靶多核苷酸扩增的下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。本发明专利技术实施例示出的免核酸提取、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对血浆、尿液等样本中铜绿假单胞菌DNA进行快速、准确的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)是医院内感染中最常见的革兰阴性条件致病菌，可引起肺炎、脑膜炎、败血症等急性或慢性感染。由于其具有多重耐药的特点，且具有先天和后天获得的耐药性，因此，其感染后的临床治疗十分困难。因此，对铜绿假单胞菌DAN检测的研究显得尤为重要。目前临床上多采样扩增检测铜绿假单胞菌DNA的方法，临床上扩增检测铜绿假单胞菌DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样本的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。目前国内有少量基于实时荧光定量PCR技术开发的铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒，但是他们存在以下缺陷；核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，检测结果的准确度低。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法，以解决国内有少量基于实时荧光定量PCR技术开发的铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒，检测过程，检测准确度低的问题。根据本专利技术的实施例第一方面，提供了一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液，阳性对照，阴性对照和内标；所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；所述引物包括上游引物和下游引物；所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列为：TL-P:5'-FAM-CGGCTTCGTCGCTCAGGCTGC-BHQ1-3'；所述上游引物和所述下游引物的碱基对序列分别为：上游引物TL-F：5'-ACCCGAACGCAGGCTATGG-3'；下游引物TL-R：5'-GAGCTGTCGTACTCGAAGTAGAAG-3'。所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。进一步，所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，所述内标的碱基对的序列为：5’-ACCCGAACGCAGGCTATGGCAGTTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGGGCAATTCCTTTCTGGTCGACTACGTATCTCTTCTACTTCGAGTACGACAGCTC-3’。进一步，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱基对序列为：IC-P:5'-HEX-TTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGG-BHQ1-3'。进一步，所述PCR反应液还包：ROX溶液。进一步，所述酶混合液由1U/μl～5U/μl耐热DNA聚合酶和0.05U/μl～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶组成。进一步，所述PCR缓冲液由浓度为200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为30mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积/体积为0.2％曲拉通溶液和体积/体积为10％甲酰胺溶液组成，其中，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的pH为7.5。进一步，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00～5.00E+05IU/ml的铜绿假单胞菌病毒的灭活血清。进一步，所述核酸释放剂包括：浓度为0.02～0.6mM/L的莎梵婷、浓度为60～220mM/L的氯化钾、浓度为0.02％～3％mM/L十二烷基磺酸钠和体积/体积为0.01％～2％的乙醇。进一步，所述阴性对照为不含有铜绿假单胞菌病毒、丙肝病毒、艾滋病毒以及梅毒的灭活阴性血清。本专利技术实施例第二方面示出一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测方法，所述检测方法包括以下步骤：S101：向每个PCR反应管中均加入核酸释放剂4～20μl，并依次加入待测样本，阴性对照，阳性对照；S102；向每个PCR反应管中均加入PCR混合液35～50μl，2000rpm离心30秒，取上清液，放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试，其中每个PCR反应管中加入PCR混合液为反应液35～45μl，酶混合液1～4μl和内标0.1～1μl。由以上技术方案可知，本专利技术实施例示出一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒及检测方法,所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液，阳性对照，阴性对照和内标；所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。本专利技术实施例示出的检测试剂盒对铜绿假单胞菌已知基因oprl的序列进行比对分析的基础上，找到该基因最保守区域，设计引物和探针，经过大量的筛选，选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出铜绿假单胞菌DNA，但不能检测出非铜绿假单胞菌病原体，具有较高的特异性，因此大大提高了检测灵敏度，准确度和稳定性，同时本专利技术实施例示出的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR的检测方法，选择了核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外膜，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA的释放和提取；所述方法具体有检测准确度高，操作快速，方法简单和线性范围宽等优点。本专利技术实施例示出的免核酸提取、检测方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对血浆、尿液等样本中铜绿假单胞菌DNA进行快速、准确的检测，检测结果可用于铜绿假单胞菌感染的辅助诊断。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1为根据一优选实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于,所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液，阳性对照，阴性对照和内标；所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列为TL‑P:：5'‑FAM‑CGGCTTCGTCGCTCAGGCTGC‑BHQ1‑3'；所述用于靶多核苷酸检测的引物包括上游引物和下游引物,碱基对序列分别为：上游引物TL‑F：5'‑ACCCGAACGCAGGCTATGG‑3'；下游引物TL‑R：5'‑GAGCTGTCGTACTCGAAGTAGAAG‑3'；所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于,所述检测试剂盒包括PCR反应液，酶混合液，阳性对照，阴性对照和内标；所述PCR反应液包括：PCR缓冲液、核酸释放剂、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸检测的探针；所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列为TL-P:：5'-FAM-CGGCTTCGTCGCTCAGGCTGC-BHQ1-3'；所述用于靶多核苷酸检测的引物包括上游引物和下游引物,碱基对序列分别为：上游引物TL-F：5'-ACCCGAACGCAGGCTATGG-3'；下游引物TL-R：5'-GAGCTGTCGTACTCGAAGTAGAAG-3'；所述上游引物与所述下游引物可以同时用于靶多核苷酸的扩增和内标扩增的引物。2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，所述内标的碱基对的序列为：5’-ACCCGAACGCAGGCTATGGCAGTTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGGGCAATTCCTTTCTGGTCGACTACGTATCTCTTCTACTTCGAGTACGACAGCTC-3’。3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱基对序列为：IC-P:5'-HEX-TTCCTCGTTCGATTTCACTTTTAGG-BHQ1-3'。4.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包：ROX溶液。5.根据权利要求1-4所述的铜绿假单胞菌核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液由...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，易晓明，王铁军，邓中平，刘佳，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43