本发明专利技术公开了一种基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法，具体包括以下步骤：首先制备假单胞菌浓度已知的标准土样，提取标准土样和待测土样DNA；再建立荧光定量PCR反应程序和反应体系，最后待测土样假单胞菌浓度的检测；本发明专利技术对假单胞杆菌常规平板涂布计数法进行改进，以假单胞菌浓度已知的标准土样绘制标曲从而定量检测待测土样中的假单胞菌，所得结果单位为菌数每克土，操作步骤高效、方便，同时准确的检测出土壤中假单胞菌浓度，宜于大规模推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别是一种定量检测土壤中假单胞菌的方法。
技术介绍
假单胞菌(Pseudomonadaceae)在分类学上属于细菌域、变形菌门、γ-变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属。假单胞菌广泛存在于土壤中，是研究最深入的土壤微生物种群之一。假单胞菌是土壤微生态系统和土壤碳氮循环的重要组成部分。很多假单胞菌能改善植物微环境，并且诱导植物系统抗性、抑制病原微生物侵染根系，有促进植物生长和防治植物病害的作用。一些假单胞菌还具有降解利用多种人工合成化合物的潜力。此外，假单胞菌的某些种对重金属和有机污染物具有抗性并可将其在体内富集。对土壤中假单胞菌的定量检测可以更好的分析土壤微生物生态功能、土壤抑病性能力和污染土壤的微生物修复能力等。目前对土壤中假单胞菌的定量检测方法主要是平板涂布计数法(Elad和Baker，1985；Garbeva等，2006)。平板涂布计数法为土壤浸提液经梯度稀释后涂布在选择性培养基上，再进行假单胞菌菌落计数，进而计算出土壤中假单胞菌浓度，这种方法存在较大的误差和困难，准确性低、费时，且易受杂菌影响，对试验人员假单胞菌识别能力要求高。随着分子生物学技术日益成熟，现在在DNA水平上采用定量PCR技术对土壤中假单胞菌进行定量检测(Kaare等，1999)，但常规定量PCR以拷贝数或者基因组浓度量化待测样品，所得结果单位为拷贝数每克土或者ng基因组DNA每克土，而非菌数每克土，不能直观的了解土壤中假单胞菌的浓度。且不同批次检测结果系统误差较大，同一样品的不同批次定量结果可能存在千倍以上的差异。因此，常规定量PCR在检测土壤中假单胞菌浓度时也具有局限性。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种采用定量PCR技术以假单胞菌浓度已知的标准土样绘制标曲从而定量检测待测土样中的假单胞菌，可用于假单胞菌的跟踪检测，为研究假单胞菌对土壤的生态适应性和假单胞菌相关土壤生态功能提供了一种简便、高效的方法，本专利技术是这样实现的：一种基于标准样品的土壤中假单胞菌的定量检测方法，其具体步骤如下：a)分别制备假单胞菌浓度依次为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL(CFU/mL是指活菌数每毫升菌液，下同)的系列梯度标准土样；b)利用土壤微生物DNA提取试剂盒分别提取系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA，提取步骤严格依照说明书进行；c)选定可扩增假单胞菌的特异性引物(Widmer专利技术，1998)，合成特异性上下游引物SEQIDNO.1(Psf)和SEQIDNO.2(Psr)；分别以步骤b)中获得系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为上下游引物，进行荧光定量PCR反应；d)根据系列梯度标准土样假单胞菌浓度的对数值和相应的阈值循环数作图，并进行线性拟合得到标准曲线：y＝40.765-4.755x，R2＝0.991；将待测土样荧光定量PCR反应结果(阈值循环数和线性方程)代入标准曲线，即可获得待测土样中假单胞菌的浓度。进一步，本专利技术所述基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法中，步骤c)所述荧光定量PCR反应体系为：2×SYBRPremixExTaq10μL，浓度均为10μmol/L上下游引物各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，浓度为40-60ng/μLDNA模板2μL，灭菌超纯水补足至20μL；反应程序为：95℃预变性30s；95℃预变性5s，65℃退火34s，共40个循环。进一步，本专利技术所述基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法中，所述系列梯度标准土样是这样获得的：a)取耕地土壤126℃灭菌120min，风干后即获得获得土样；b)将假单胞菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化，活化后的假单胞菌接种到装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、160r/min摇床培养2天后，平板计数后备用；用无菌水将菌液依次稀释为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL；分别取20mL稀释后的菌液加入到100g步骤a)获得的土样中(即体积质量比1:5，mL/g)并快速风干(强通风阴暗条件下12h内风干土壤)，即获得假单胞菌浓度依次为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL的系列梯度标准土样。本专利技术中，Psf和Psr可对假单胞菌特异性扩增出990bp的产物。本专利技术所涉及的平板计数法是参照文献[沈萍，范秀荣，李广武。微生物学实验[M]。北京：高等教育出版社，1999,92-94]进行，其具体步骤为：用1mL无菌吸管，吸取1mL菌液移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次混匀菌液，即成10-1稀释液；再换一支无菌吸管吸取1mL10-1稀释液移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次混匀菌液，即成10-2稀释液；以此类推，连续稀释制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释液。各稀释液均吸取0.1mL到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，用无菌刮铲涂匀至干。37℃培养三天后计数，菌液浓度＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数。即知菌悬液中假单胞菌的浓度。本专利技术提供的用于定量检测土壤中假单胞菌浓度的方法，可对土壤中假单胞菌进行快速检测定量，与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)实用性强，反应土壤真实假单胞菌浓度。本专利技术方法，可以替代一直沿用的平板涂布计数和常规定量PCR技术，通过改进常规定量PCR技术，以假单胞菌浓度已知的标准土样DNA做为定量PCR标曲DNA，可计数出待测土样中的假单胞菌浓度，所得数据单位为菌数每克土，这样即可避免传统平板涂布计数法结果的不可靠性，又可避免常规定量PCR结果的不直观性。(2)重复性高。已知假单胞菌浓度的标准土样DNA与待测土样DNA同时进行定量PCR，利用每个样品在荧光闽值处所经历的循环数(Ct)和标准样品的假单胞菌浓度建立标准曲线，根据待测样品Ct值在标准曲线上计算对应的假单胞菌浓度。这样可有效消除同一土样进行不同批次检测的系统误差。即同一土样不同批次检测结果差异较小。(3)操作简便快捷，应用本专利技术方法，对标准土样和待测土样进行土壤微生物DNA提取，再进行定量PCR即可得出结果，操作简便，适于检测土壤中假单胞菌浓度及对其进行实时检测。附图说明图1为特异性检测引物对假单胞菌及其它常见土壤细菌的扩增结果；图中：泳道1-2位假单胞菌，3-4为芽孢杆菌，5-6为链霉菌，7-8为大肠杆菌，9-10为农杆菌，11-12为阴性对照。图2为本专利技术对土壤中假单胞菌的灵敏度检测试验扩增曲线，样品阈值循环数从高到底依次对107、106、105、104、103、102和10假单胞菌/g风干土。图3为标准样品和待测样品的假单胞菌荧光定量PCR溶解曲线图，溶解温度为88.5℃。图4为标准样品和待测样品的假单胞菌荧光定量PCR扩增曲线图，纵坐标为循环数，横坐标为土壤假单胞菌浓度。图5为标准样品和待测样品的假单胞菌荧光定量PCR标准曲线图，y＝40.765-4.755x，R2＝0.991。具体实施方式以下结合具体实施例对本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法，其特征在于，具体步骤如下：a）分别制备假单胞菌浓度依次为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50 CFU/mL的系列梯度标准土样；b）分别提取系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA；c）分别以步骤b）中获得系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，进行荧光定量PCR反应；d）根据系列梯度标准土样假单胞菌浓度的对数值和相应的阈值循环数作图，获得标准曲线：将待测土样荧光定量PCR反应结果代入标准曲线，即可获得待测土样中假单胞菌的浓度。
【技术特征摘要】
1.一种基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法，其特征在于，具体步骤如下：a）分别制备假单胞菌浓度依次为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL的系列梯度标准土样；b）分别提取系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA；c）分别以步骤b）中获得系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为上下游引物，进行荧光定量PCR反应；d）根据系列梯度标准土样假单胞菌浓度的对数值和相应的阈值循环数作图，获得标准曲线：将待测土样荧光定量PCR反应结果代入标准曲线，即可获得待测土样中假单胞菌的浓度。2.根据权利要求1所述基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法，其特征在于，步骤c）所述荧光定量PCR反应体系为：2×SYBRPremixExTaq10μL，浓度均为10μmol/L的上下游引物各0...
【专利技术属性】
技术研发人员：王光飞，马艳，郭德杰，王秋君，宋修超，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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