本发明专利技术公开了一种减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌，命名为PAO1aroA，是其基因组中已敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5‑烯醇丙酮酞莽草酸‑3‑磷酸合成酶)且含有过表达质粒pBBR1‑oriT‑rhlAB‑estA‑genta的铜绿假单胞菌(Pseudomas aeruginosa)；该工程菌是将一段携带短同源臂的抗性基因DNA片段，整合到铜绿假单胞菌的染色体，将绿脓杆菌中的芳香族氨基酸合成相关基因aroA进行敲除，构建减毒菌株；再构建广谱型复制子pBBRI过表达载体，增加鼠李糖脂生物合成中关键酶基因EstA和RhlAB的拷贝数，获得了高产鼠李糖脂减毒菌株，该菌株可以直接应用于工业化生产鼠李糖脂，其产量完全可以达到工业生产的要求，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一株减毒高产鼠李糖脂的工程菌株及其构建与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株减毒高产鼠李糖脂的工程菌株及其构建与应用。
技术介绍
鼠李糖脂是由假单胞菌或伯克氏菌类产生的一种生物表面活性剂，也是研究时间最长、应用技术最为成熟的一种生物表面活性剂。它在土壤、水体和植物中都自然存在，属于一种糖脂类的阴离子表面活性剂，不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在碱性水溶液中也表现出良好的溶解特性。它兼具良好的化学和生物特性，具有油、水两亲性，可以降低水表面张力，可以作为润湿剂、乳化剂和发泡剂使用，无毒、能生物降解，在温度、PH值及盐度处于极端状况下也可使用。目前，工业上主要采用铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)发酵法生产鼠李糖脂，而铜绿假单胞菌被认为是三种最强人类条件致病菌之一，故限制了其在工业生产中的广泛应用。基于此，人们期望选择利用相对安全的工业微生物进行鼠李糖脂的生产，以降低其在生产中的潜在危害，拓展相关产品的应用范围。已报到的有利用伯克氏菌Burkholderia、绿针假单胞菌Pseudomonaschlororaphis等非条件致病菌生产鼠李糖脂，但由于这些微生物遗传背景相对不清晰且缺乏简便的遗传操技术，很难进一步提高鼠李糖脂的产量，无法满足生产要求。人们也尝试选择非致病微生物如大肠杆菌通过异源表达来生产鼠李糖脂，而大肠杆菌作为一种“一般认为安全(GRAS)”的模式生物，虽具有清晰的遗传背景、成熟的遗传操作技术及广泛的工业应用，是异源合成鼠李糖脂合适的选择，但是其产量却远远达不到工业生产的要求。经过文献检索，有关通过敲除铜绿假单胞菌的芳香族氨基酸合成相关基因5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA实现减毒，且将该减毒菌鼠李糖脂合成相关基因自转运酯酶基因EstA和鼠李糖基转移酶复合物基因RhlAB构建到一个以pBBRI为复制子的多拷贝质粒上，增加鼠李糖脂合成相关基因的拷贝数，实现增加鼠李糖脂产量的文献或专利还未见报道。
技术实现思路
针对目前鼠李糖脂工业化生产菌株的高毒性或者低产量，本专利技术的目的是提供一株减毒高产鼠李糖脂的工程菌株——重组绿脓杆菌工程菌及其构建与应用。本专利技术所述减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌，其特征在于：该工程菌是其基因组中已敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)且含有过表达质粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的铜绿假单胞菌(Pseudomasaeruginosa)，命名为PAO1aroA；其中，所述过表达质粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术所述减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌的构建方法，步骤是：利用假单胞菌噬菌体的重组酶构建的同源重组系统，将一段50bp-100bp的携带短同源臂的抗性基因DNA片段整合到铜绿假单胞菌(Pseudomasaeruginosa)的染色体上，实现敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)，获得减毒铜绿假单胞菌，再构建包含鼠李糖脂合成的转运酯酶基因EstA和鼠李糖基转移酶复合物基因RhlAB，庆大霉素抗性基因，接合转移起始位点oriT和一个广谱型复制子pBBRI的过表达质粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta，并将该过表达质粒转入获得的减毒铜绿假单胞菌中，即得到通过多拷贝质粒增加该菌鼠李糖脂合成相关基因的拷贝数实现的减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌。本专利技术所述减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌在工业化生产鼠李糖脂中的应用。本专利技术构建的鼠李糖脂减毒高产的铜绿假单胞菌菌株，它不仅可以提高鼠李糖脂产量，而且毒性减低。实验证实：通过敲除铜绿假单胞菌PAO1(PseudomasaeruginosaPAO1)的芳香族氨基酸合成相关基因5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA后，突变株毒性检测证明该菌已减毒。同时，本专利技术将该减毒菌鼠李糖脂合成相关基因自转运酯酶基因EstA和鼠李糖基转移酶复合物基因RhlAB构建到一个以pBBRI为复制子的多拷贝质粒上，从而增加鼠李糖脂合成相关基因的拷贝数，最终达到增加鼠李糖脂产量的目的。这种方法也适用于其它细菌次生代谢产量的提高，具有非常重要的应用价值。本专利技术构建的鼠李糖脂减毒高产的铜绿假单胞菌菌株可以直接应用于工业化生产鼠李糖脂，其产量完全可以达到工业生产的要求，具有广阔的应用前景。附图说明图1.高效同源重组系统介导的aroA基因敲除。(A)aroA基因敲除示意图；携带同源臂和位点特异重组酶识别位点(LoxM)的庆大霉素抗性基因将aroA基因替换后，再诱导位点特异性重组酶cre酶将loxM位点之间的庆大霉素抗性基因敲除。(B)菌落PCR检测基因敲除后的重组子，M:DL5000marker；1，2：庆大霉素抗性基因替换aroA基因，扩增的PCR片段，大小1073bp。引物是aroA-chk-5和aroA-chk-3。(C)菌落PCR检测cre位点特异性重组后的重组子，M：DL5000；1：野生型的PAO1作为模板扩增大小675bp，2：庆大霉素基因替换了aroA之后的PAO1作为模板扩增大小是1257bp，3：Cre酶敲除庆大霉素抗性基因之后的PAO1作为模板，扩增大小438bp。所用的引物是aroA-chk-5和aroA-chk-3。图2.野生株和突变株的生长曲线测定和毒性检测。(A)PAO1野生株和PAO1突变株的生长曲线测定。在OD600的条件下测定菌体的浓度。红色线代表PAO1野生株，蓝色线代表PAO1突变株。结果显示野生型菌株在转接后2小时进入指数生长期，但是突变型菌株需要在转接后5小时才能进入指数生长期。(B)PAO1野生株和PAO1突变株毒性检测：蓝色线代表PAO1突变株，结果显示小鼠的存活率是100％。红色线代表的是野生型的PAO1，在注射了野生型PAO1之后第9个小时，小鼠的存活率为0，小鼠全部死亡。图3.鼠李糖脂高产菌株的构建。(A)构建pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM的示意图。(B)pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-lox质粒PVUII酶切图；M：DL5000；1-20为20个重组子。其中1，3，4，8，9，10，11，16，17，18，20是正确的克隆。(C)pBBRI-EstA-RhlAB-loxM-genta-oriT质粒图。(D)pBBRI-EstA-RhlAB-loxM-genta-oriT质粒PVUII酶切图；M:DL5000；1-10为10个重组子，其中1，2，3，6，7，9，10为正确的克隆。图4.鼠李糖脂产量的测定。(A)不同时间点的鼠李糖脂产量测定。(B)鼠李糖标准曲线：配制不同浓度的鼠李糖溶液，在421nm下测定OD值，以鼠李糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，真实的鼠李糖脂的产量应是鼠李糖产量的3倍。(C)根据(B)中数据得出的标准曲线，我们将(A)中第二天四株菌的OD421的值代入得到的公式中，计算出了第二天四株菌中鼠李糖脂的产量。图5.鼠李糖脂乳化实验结果照片：相等体积的甲苯和菌体发酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌，其特征在于：所述工程菌是其基因组中已敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5‑烯醇丙酮酞莽草酸‑3‑磷酸合成酶)且含有过表达质粒pBBR1‑oriT‑rhlAB‑estA‑genta的铜绿假单胞菌(Pseudomas aeruginosa)，命名为PAO1aroA；其中，所述过表达质粒pBBR1‑oriT‑rhlAB‑estA‑genta的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌，其特征在于：所述工程菌是其基因组中已敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)且含有过表达质粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的铜绿假单胞菌(Pseudomasaeruginosa)，命名为PAO1aroA；其中，所述过表达质粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述减毒高产鼠李糖脂的重组绿脓杆菌工程菌的构建方法，步骤是：利用假单胞菌噬菌体的重组酶构建的同源重组系统，将一段50bp-100bp的携带短同源臂的抗性基因DNA片段整合到铜绿假单胞菌(Pseudomasaeruginosa)的染色体上，实现敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)，获得减毒铜绿假单胞菌，再构建包含鼠李糖脂合成的转运酯酶基因EstA和...
【专利技术属性】
技术研发人员：张友明，尹佳，符军，姜婵娟，
申请(专利权)人：山东大学苏州研究院，山东大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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