柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法包括步骤：(1)提取柑橘溃疡病菌DNA；(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：A、以引物Hfq‑up‑F、Hfq‑up‑R，Hfq‑down‑F、Hfq‑down‑R分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列；B、回收PCR片段；C、将回收产物分别与载体pEASY‑T

【技术实现步骤摘要】
柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种基因无标记缺失突变体的筛选方法，具体涉及一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法。
技术介绍
柑橘溃疡病菌(拉丁名：Xanthomonascitrisubsp.citri,Xcc)为假单胞菌目、黄单胞菌科、黄单胞杆菌属，引起柑橘溃疡病。革兰氏阴性菌，好气性，短杆菌。造成的病害主要发生在叶、小枝、刺、老枝和果实上，引起落果和落叶。目前在细菌中应用的基因突变策略主要有三种：(1)携带目的基因部分片段的自杀载体通过单交换同源重组实现基因插入突变；(2)转座子介导目的基因体外突变，然后与目的基因双交换同源重组实现基因插入或缺失；(3)自杀载体中引入负选择标记，实现目标基因无标记缺失，这种突变具有不引入抗生素基因，且一次可敲除多个基因等优点。自杀载体是指能在一种宿主内复制但在另一宿主中却不能的质粒或噬菌体。枯草芽孢杆菌的SacB基因被引入至异源宿主(主要是革兰氏阴性菌)时，其在外源蔗糖存在的情况下会导致宿主死亡。SacB基因介导的无标记基因缺失突变体系已经广泛运用到多种革兰氏阴性和阳性细菌中，其中常用的自杀载体就是pK18mobSacB。革兰氏阴性植物病原菌在SacB基因的存在下，于5％-10％的蔗糖培养基上产生致死表型。该基因介导的无标记基因缺失体系，需通过同源双交换来进行，传统的方法是先扩增缺失基因的上下游侧翼序列，然后经过酶切连接等手段将上下侧翼序列连接到自杀载体pK18mobSacB(该载体上面还有卡那霉素抗性基因)，转化重组质粒到宿主细胞。经卡那霉素和无糖固体培养基筛选经电转将质粒整合到宿主基因组上的重组子。筛选的转化子经无糖培养基扩大培养后转接到含5％-10％蔗糖的液体培养基，使其产生蔗糖筛选压力。最后将蔗糖液体培养基的菌液涂布到蔗糖固体培养基，获得单菌落，并将这些单菌落一一划线到有抗和无抗平板上，对比有抗平板上不能生长而在无抗平板上能生长的菌落进行PCR检测，寻找突变体，最后进行一系列验证。传统的筛选方法效率较低，且工作量大。并且，目前没有关于柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述技术问题，提供一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，包括如下步骤：(1)提取柑橘溃疡病菌基因组DNA；(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：A、分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列：以柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，以引物Hfq-up-F、Hfq-up-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，以引物Hfq-down-F、Hfq-down-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列；所述引物Hfq-up-F、Hfq-up-R、Hfq-down-F、Hfq-down-R的序列为：Hfq-up-F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT，Hfq-up-R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT，Hfq-down-F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC，Hfq-down-R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA；B、分别回收步骤A得到的柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列PCR扩增产物片段；C、将步骤B的回收产物分别与载体pEASY-T1vector连接，得到上游T-载体连接产物和下游T-载体连接产物；D、将步骤C得到的上游/下游T-载体连接产物分别转化大肠杆菌；E、提取步骤D中的阳性克隆的质粒，分别得到上游T-载体重组质粒和下游T-载体重组质粒；F、用BamHI和KpnI双酶切上游T-载体重组质粒，用KpnI和XbaI双酶切下游T-载体重组质粒，用BamHI和XbaI双酶切质粒pK18mobSacB；G、将步骤F得到的上/下游T-载体重组质粒与质粒pK18mobSacB酶切后产物进行连接，将连接液转化入DH5α大肠杆菌感受态，保存经筛选获得的阳性克隆即缺失hfq基因的重组自杀质粒载体；(3)将步骤G构建好的缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞，挑取转化后经Kan+无糖NA筛选的单菌落；(4)将步骤(3)挑取的单菌落用蔗糖培养基筛选，即得突变体。所述步骤A中分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列，扩增上、下游侧翼序列的PCR反应体系为：2×TaqPCRMix10μL、10mM的上下游引物各0.5μL、浓度为100～200ng/μL的柑橘溃疡病菌基因组DNA0.5μL、加ddH2O补足至20μL；扩增上游侧翼序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃10min；扩增下游侧翼序列的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s，32个循环；72℃10min。本专利技术的另一方面提供了一种用蔗糖培养基筛选柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的方法，包括如下步骤：(1)挑取前述步骤(3)中缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞后经Kan+无糖NA筛选的单菌落，接到无蔗糖的NB培养基中培养过夜；(2)将步骤(1)扩繁的菌液转接到新的无糖NB培养基中，连续培养4-5代；(3)将步骤(2)获得的菌液，稀释后涂布到Kan+无糖NA的筛选培养基上，28～30℃，放置24～36h；(4)将步骤(3)获得的单菌落一一划线到含有5～10％的蔗糖的NA培养基，28～30℃，培养68～72h；(5)将步骤(4)获得的菌落，再一一划线到对应的Kan+无糖NA和5～10％蔗糖NA板上，放置24～36h；(6)将步骤(5)中抗性平板上不能生长而在无抗平板上能生长的菌落，进行初步验证突变；(7)将步骤(6)获得的疑似突变体菌落，挑到NB培养基中培养，连续传代，将能稳定遗传的菌落进行验证，得到柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体。在上述技术方案中，所述步骤(6)中验证突变的方法为PCR验证：提取突变体的基因组DNA，用检测突变的引物Hfq-F/Hfq-R验证缺失片段的大小是否与目的基因hfq的大小一致，所述引物Hfq-F/Hfq-R的序列为：Hfq-F：GCTTCAGGCGTGTAACATCC，Hfq-R：GCGAACTCCTCCAACACATC。作为优选地，所述步骤(6)中验证突变的方法为测序验证或者Southernblot验证。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次成功筛选出了柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体，为进一步研究hfq的致病机理、鉴定hfq直接调控靶标，以及发掘与hfq相互作用的sRNA等奠定基础，同时为柑橘溃疡病菌的防治研究工作奠定了良好的基础。本专利技术的蔗糖培养基筛选柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的方法成功地得到了突变体，解决了传统蔗糖培养基筛选方法找不到突变体或者需要大量的挑单菌落划线才能找到很少的突变体的问题，本专利技术方法工作量大大减少、筛选效率更高。附图说明图1是本专利技术方法的流程示意图，1：扩增侧翼序列；2：侧翼序列融合；3：缺失载体；4、5：第一次交换；6：第二次交换；7：缺失突变体。图2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取柑橘溃疡病菌基因组DNA；(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：A、分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列：以柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，以引物Hfq‑up‑F、Hfq‑up‑R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，以引物Hfq‑down‑F、Hfq‑down‑R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列；所述引物Hfq‑up‑F、Hfq‑up‑R、Hfq‑down‑F、Hfq‑down‑R的序列为：Hfq‑up‑F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT，Hfq‑up‑R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT，Hfq‑down‑F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC，Hfq‑down‑R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA；B、分别回收步骤A得到的柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列PCR扩增产物片段；C、将步骤B的回收产物分别与载体pEASY‑T

【技术特征摘要】
1.一种柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取柑橘溃疡病菌基因组DNA；(2)缺失hfq基因的重组自杀质粒载体的构建：A、分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列：以柑橘溃疡病菌基因组DNA为模板，以引物Hfq-up-F、Hfq-up-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上游侧翼序列，以引物Hfq-down-F、Hfq-down-R扩增柑橘溃疡病菌hfq基因下游侧翼序列；所述引物Hfq-up-F、Hfq-up-R、Hfq-down-F、Hfq-down-R的序列为：Hfq-up-F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT，Hfq-up-R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT，Hfq-down-F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC，Hfq-down-R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA；B、分别回收步骤A得到的柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列PCR扩增产物片段；C、将步骤B的回收产物分别与载体pEASY-T1vector连接，得到上游T-载体连接产物和下游T-载体连接产物；D、将步骤C得到的上游/下游T-载体连接产物分别转化大肠杆菌；E、提取步骤D中的阳性克隆的质粒，分别得到上游T-载体重组质粒和下游T-载体重组质粒；F、用BamHI和KpnI双酶切上游T-载体重组质粒，用KpnI和XbaI双酶切下游T-载体重组质粒，用BamHI和XbaI双酶切质粒pK18mobSacB；G、将步骤F得到的上/下游T-载体重组质粒与质粒pK18mobSacB酶切后产物进行连接，将连接液转化入DH5α大肠杆菌感受态，保存经筛选获得的阳性克隆即缺失hfq基因的重组自杀质粒载体；(3)将步骤G构建好的缺失hfq基因的重组自杀质粒载体转化柑橘溃疡病菌感受态细胞，挑取转化后经Kan+无糖NA筛选的单菌落；(4)将步骤(3)挑取的单菌落用蔗糖培养基筛选,即得突变体。2.如权利要求1所述的柑橘溃疡病菌hfq基因无标记缺失突变体的筛选方法，其特征在于，所述步骤A中分别扩增柑橘溃疡病菌hfq基因上、下游侧翼序列，扩增上、下游侧翼序列的PCR反应体系为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪峰，严玉萍，刘雪禄，邹华松，
申请(专利权)人：中国农业科学院柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：重庆,50