本发明专利技术公开了一组同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重PCR引物及其应用。该组引物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。这组引物可以在一个双重PCR反应中分别检测到两种葡萄溃疡病菌-小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的存在，这表明该组引物可以快速、准确、灵敏的确定葡萄苗木以及田间葡萄病样中的上述两种葡萄溃疡病菌，为苗木带菌检测和针对性防治这2种病原菌引起的葡萄溃疡病提供依据。
【技术实现步骤摘要】
同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重PCR引物及其应用
本专利技术属于本专利技术属于植物真菌病原物分子检测新技术，具体涉及采用双重PCR技术检测两种葡萄溃疡病菌的方法的建立及其应用。
技术介绍
由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌引起的葡萄溃疡病(grapeBotryosphaeriadieback)近年来在世界范围内危害日益加重，已经成为威胁葡萄品质和产量的重要因素之一(PascoeI.Trunkdiseasesofgrapevines-perspectivefromatourofCalifornia.TheAustralianGrapegrowerandWinemaker.1998,417:68-71.VanNiekerkJM,FouriePH,HallennF,etal.Botryosphaeriaspp.asgrapevinetrunkdiseasepathogens.PhytopathologiaMediterranea.2006,45(4):43-54.Urbez-TorresJR.ThestatusofBotryosphaeriaceaespeciesinfectinggrapevines.PhytopathologiaMediterrianea.2011,50:5-45.)。截至目前，报道显示在葡萄座腔菌科中有17个种可引起葡萄溃疡病(AugerJ,EsterioM,RickeG,etal.BlackdeadarmandbasalcankerofVitisviniferacv.RedGlobecausedbyBotryosphaeriaobtusainChile.PlantDisease.2004,88(11):1286.URbez-TorresJR,PedutoF,StrieglerRK,etal.CharacterizationoffungalpathogensassociatedwithgrapevinetrunkdiseasesinArkansasandMissouri.FungalDiversity.2012:1-21.URbez-TorresJR,GublerWD.PathogenicityofBotryosphaeriaceaespeciesisolatedfromgrapevinecankersinCalifornia.PlantDisease.2009,93(6):584-592.)。在我国已发现并报道的葡萄溃疡病病原菌有Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodiatheobromae、Neofusicoccumparvum和Diplodiaseriata四个种(LiXH,YanJY,KongFF,etal.BotryosphaeriadothideacausingcankerofgrapevinenewlyreportedinChina[J].PlantPathology.2010,59(6):1170.YanJY,PengYL,XieY,etal.FirstReportofGrapevineTrunkDiseaseCausedbyBotryosphaeriaobtusainChina[J].PlantDisease.2011,95(5):616.YanJY,LiXH,KongFF,etal.OccurrenceofGrapevineTrunkDiseaseCausedbyBotryosphaeriarhodinainChina[J].PlantDisease.2011,95(2):219.YanJY,XieY,ZhangW,etal.SpeciesofBotryosphaeriaceaeinvolvedingrapevinediebackinChina.FungalDiverisity.2013,61:221-236.)。研究表明，在我国Neofusicoccumparvum主要分布在亚热带季风气候区，Botryosphaeriadothidea则在温带季风气候区和亚热带季风气候区均有分布，病原菌侵染葡萄后带来严重的损失(YanJY,XieY,ZhangW,etal.SpeciesofBotryosphaeriaceaeinvolvedingrapevinediebackinChina.FungalDiverisity.2013,61:221-236.)。在实际生产中，葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)两种病原菌常混合侵染，带来更为严重的损失。准确的早期诊断能够为病害有效防控提供依据。由于葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)常混合侵染，且侵染葡萄后引起的症状相似，很难区分，导致传统的早期诊断方法无法快速的得到准确结果。而常规的分子生物学技术——聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)技术则可以快速、准确的检测到微量病原菌的存在，已被广泛应用于动植物病害的诊断及病原菌的鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一组能够用于同时检测两种葡萄溃疡病菌-葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)的双重PCR引物以及一种操作简便、结果可靠的上述两种葡萄溃疡病菌的双重PCR检测方法。基于上述专利技术目的，根据葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)EF延伸因子和β-tubulin序列上的差异位点，分别设计了上述两种病原菌的特异性引物，通过对PCR反应程序、体系的反复摸索，建立了这两种病原菌的双重PCR检测体系，能够将葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)快速准确的区分开来，对开展苗木带菌检测和葡萄园病原菌动态监测具有重要意义。本专利技术所提供的检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。其能够同时用于检测葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)。本专利技术的另一目的是提供一种同时检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)的试剂盒，包括所述的双重PCR引物组。在本专利技术的一个技术方案中，所述试剂盒中还包括PCR反应试剂；所述PCR反应试剂包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、浓缩PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。其中，浓缩PCR缓冲液即为10×PCR缓冲液，是由100mmol/LTris-HClpH8.3，500mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2组成的溶液。上述双重PCR引物组以及包括该引物组的试剂盒在检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。
【技术特征摘要】
1.一组检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。2.根据权利要求1所述的检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物组，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。3.一种同时检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)的试剂盒，包括权利要求1或2所述的双重PCR引物组。4.根据权利要求3所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。5.权利要求1或2所述的双重PCR引物组、权利要求3或4所述的试剂盒在检测小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)中的应用。6.一种同时检测葡萄溃疡病菌中的小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)的方法，包括下述步骤：1)提取待测样品DNA；2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的双重PCR...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玮，燕继晔，李兴红，郭飞飞，刘梅，周莹，陈震，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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