【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，尤其涉及一种金鱼crispr/cas12基因编辑方法及其应用。
技术介绍
1、几乎所有的古细菌和细菌都通过一系列不同的crispr/cas(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats and crispr-associatedproteins，规律成簇的间隔短回文重复序列和crispr相关蛋白)系统实现适应性免疫，使其在进化过程中抵御外界病原体的侵袭，形成了一种“适应性免疫防御系统”。之后crispr/cas系统应用到真核生物基因组编辑中，其能够对基因组进行定点修饰和编辑，被称为第三代基因编辑工具。基于crispr/cas系统的基因编辑技术是研究基因功能最准确的手段，能够在不引入外源基因的情况下对靶基因实现定点编辑，极大拓展了基因工程领域。根据cas蛋白种类和结构的不同，crispr/cas系统包括很多种，其中应用广泛的是ii型cas系统即crispr/cas9和crispr/cas12系统。cas9蛋白来源于酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)，cas12核酸酶主要来源于氨基酸球菌属(acidaminococcus sp)和毛螺菌属(lachnospiraceae bacterium)。crispr/cas9系统已经被广泛应用到动植物的基因功能研究中，用以提高动植物产量、改良品质、抗病性和抗逆性，已然成为动植物品种改良的重要工具。crispr/cas12系统主要应用于模式物种的基因编辑动植物的基因组编辑中，如水稻、
2、在长期的人为选择压力下，金鱼产生了众多有趣而独特的形态变异，这些变异在其他鱼类甚至是模式鱼类中并未发现，这也使金鱼成为国内外研究生理、形态变异、物种进化等生物学问题的特殊研究材料。形态变异的多元化造就了金鱼种类的多样化，中国目前已有金鱼品系300余种。众多金鱼品系的产生离不开育种技术的支撑，然而中国金鱼育种还处于以选择育种和杂交育种等传统育种方式为主的2.0育种时代，育种周期长，盲目性大，育种成本高。科学高效精准育种技术的缺乏严重阻碍金鱼产业的健康全面发展，因此，建立科学有效的育种技术是解决目前金鱼产业窘境的有力手段。
3、基于crispr/cas系统的基因编辑技术为动植物育种带来了新的曙光，已经被广泛应用到各种动植物的育种工作中，用以提高动植物产量、改良品质、抗病性和抗逆性，已然成为动植物品种改良的重要工具。目前在武昌鱼、黄颡鱼和鲤鱼中均成功实现了mstn的敲除，其f0敲除个体在体重和生长速度方面显著高于对照组；利用crispr/cas9技术从肌间刺发育相关的1600多个候选基因中鉴定到调控肌间刺发育的关键基因，并获得正常发育的无肌间刺鲫f2代可遗传群体；金鱼中利用crispr/cas9技术筛选到龙睛性状关键基因，并利用该技术创制了金鱼龙睛新品系，彰显了基因编辑技术在水产动物育种领域新种质创制的巨大潜力。尽管crispr/cas9系统已经应用广泛，然而其技术本身的缺点如脱靶效应、靶位点选择受限、f0代嵌合体等问题仍然未解决，限制着其在育种领域的应用。
4、crispr/cas12系统可以在一定程度上克服cas9的以上问题。与cas9核酸酶不同，cas12核酸酶可以识别富含胸腺嘧啶的原间隔区相邻基序(pam)，通过切割非靶向链上第18个碱基之后的dna和靶向链上的23个碱基之后的dna,使其产生一个粘性末端，在pam远端实现交错切割，从而破坏基因序列。与cas9相比，cas12核酸酶具有以下优点：(1)其识别序列为tttn，靶位点选择范围更大，如启动子区、utr区、内含子区；(2)cas12a对sgrna的二级结构要求更少，不需要tracrrna，只需要可以自我加工的crrna；(3)cas12对靶位点的识别精确度更高，具有更低的脱靶率；(4)cas12切割产生的粘性末端更易通过同源修复的方式修补dna双链，可提高外源供体模板的插入效率。然而目前crispr/cas12系统的应用受限，仅仅集中于模式物种基因组编辑中，在非模式物种的应用还处于空白。因此，开发crispr/cas12系统在动植物基因编辑中的应用对促进基因功能研究具有重要的研究价值。
5、目前crispr/cas9系统在动植物基因组编辑的应用具有一些局限性，如sgrna对靶位点的识别并不精准，容易出现脱靶效应；pam序列为ngg，靶位点的选择只能在gc含量较高的区域，编辑区域受限。相比之下，cas12核酸酶对靶位点的识别精准度更高，pam识别位点为tttn，可扩大靶序列选择的选择范围，尤其针对一些非编码区、内含子等gc含量较低的区域。此外，crispr/cas系统对基因组修饰的作用并不仅仅是基因敲除(破坏基因功能)，其还可以应用于基因组的精准插入和碱基替换，即基因插入。基因插入在疾病治疗、性状改良等方面具有巨大的应用前景，然而目前其效率并不高。基因组被cas蛋白切割后，机体更倾向于启动非同源修复机制来修补断裂的dna双链，即实现基因敲除。在外源供体模板存在时，机体会在启动非同源修复的同时，会开启同源修复机制，在靶位点处实现碱基替换或插入。不同于cas9切割dna产生的平末端，cas12切割产生黏性末端，其发生同源修复的比例更高，在基因插入方面具有更高的效率。尽管金鱼中基于crispr/cas9系统的基因敲除技术已经建立，但是还是有很多变异性状相关基因并未锁定。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种金鱼crispr/cas12基因编辑方法及其应用，可以用于创制金鱼新品种。
2、本专利技术提供一种用于crrna设计的基因序列，其包括seq id no.12和/或seq idno.13所示的核苷酸序列。
3、本专利技术提供一种crrna，所述crrna的序列包括如seq id no.1-3中任一项所示的序列。
4、本专利技术还提供crrna组合，为所述crrna两项或三项的组合。
5、本专利技术还提供一种crispr/cas12基因编辑系统，包括cas12蛋白和所述crrna或所述crrna组合。
6、优选的，所述crispr/cas12基因编辑系统的靶基因为catyr基因。
7、本专利技术还提供一种引物，包括以下任一项或几项引物对：
8、(1)引物的核苷酸序列包括如seq id no.4-5所示序列；
9、(2)引物的核苷酸序列包括如seq id no.6-7所示序列；
10、(3)引物的核苷酸序列包括如seq id no.8-9所示序列；
11、(4)引物的核苷酸序列包括如seq id no.10-11所示序列。
12、本专利技术还提供一种试剂盒，包括所述crrna、所述crrna组合、所述crispr/cas12基因编辑系统、所述引物中的一种或几种。
13、优选的，还包括酚红。
14、本专利技术还提供一种基因编辑方法，包括利用所述cr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于crRNA设计的基因序列，其特征在于，其包括SEQ ID NO.12和/或SEQ IDNO.13所示的核苷酸序列。
2.一种crRNA，其特征在于，所述crRNA的序列包括如SEQ ID NO.1-3中任一项所示的序列。
3.crRNA组合，其特征在于，为权利要求2中crRNA两项或三项的组合。
4.一种CRISPR/Cas12基因编辑系统，其特征在于，包括Cas12蛋白和权利要求2所述crRNA或权利要求3所述crRNA组合；
5.一种引物，其特征在于，包括以下任一项或几项引物对：
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述crRNA、权利要求3所述crRNA组合、权利要求4所述CRISPR/Cas12基因编辑系统、权利要求5所述引物中的一种或几种；
7.一种基因编辑方法，其特征在于，包括利用权利要求2所述crRNA、权利要求3所述crRNA组合、权利要求4所述CRISPR/Cas12基因编辑系统、权利要求5所述引物或权利要求6所述试剂盒；
8.权利要求2所述crRNA、权利要求
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，获得体色为金黄色、眼睛为红色的金鱼个体；
10.一种金鱼新品种的创制方法，其特征在于，利用权利要求2所述crRNA、权利要求3所述crRNA组合、权利要求4所述CRISPR/Cas12基因编辑系统、权利要求5所述引物或权利要求6所述试剂盒、或权利要求7所述基因编辑方法；
...【技术特征摘要】
1.一种用于crrna设计的基因序列，其特征在于，其包括seq id no.12和/或seq idno.13所示的核苷酸序列。
2.一种crrna，其特征在于，所述crrna的序列包括如seq id no.1-3中任一项所示的序列。
3.crrna组合，其特征在于，为权利要求2中crrna两项或三项的组合。
4.一种crispr/cas12基因编辑系统，其特征在于，包括cas12蛋白和权利要求2所述crrna或权利要求3所述crrna组合；
5.一种引物，其特征在于，包括以下任一项或几项引物对：
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述crrna、权利要求3所述crrna组合、权利要求4所述crispr/cas12基因编辑系统、权利要求5所述引物中的一种或几种；
7.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：李绘娟，朱华，王晓雯，张蓉，刘丽丽，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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